A library of synthetic Transcription Activator-Like Effector-activated promoters for coordinated orthogonal gene expression in plants
- 作者
- Kathleen Brückner, Petra Schäfer, Ernst Weber, Ramona Grützner, Sylvestre Marillonnet, Alain Tissier
- 单位
- Department of Cell and Metabolic Biology, Leibniz Institute of Plant Biochemistry; Icon Genetics GmbH
- 杂志
- The Plant Journal（2015）
- DOI
- 10.1111/tpj.12843
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏可被正交转录因子激活的植物合成启动子库，限制了复杂转录网络和代谢工程的应用
研究策略
设计并构建包含单个dTALE结合位点（EBE002）和TATA box、两侧为简并序列的合成启动子文库，通过Golden Gate/MoClo克隆组装，在烟草瞬时表达系统中用GUS和GFP报告基因表征，并用于二萜化合物代谢工程验证
核心内容
针对植物中缺乏可被正交转录因子激活的合成启动子库、从而限制复杂转录网络与代谢工程应用的问题，本研究设计并构建了一套合成转录激活因子效应物激活启动子（STAPs）文库。每个启动子结构简单，包含单个定制dTALE结合位点（EBE002）、TATA box及两侧简并序列，通过Golden Gate/MoClo组装，在烟草瞬时表达系统中以GUS和GFP报告基因表征。研究成功获得43个测序验证的STAPs，其表达强度跨度达35S启动子的约5%至近100%，且无dTALE时无背景表达，正交性强。在二萜代谢工程验证中，STAPs驱动的CBTS2a、GGPPS2和DXS2转录水平分别比35S启动子高1.9倍、11.5倍和1.5倍，但目标产物CBToI产量约为35S体系的1/3。结果表明，STAPs可作为植物代谢工程和合成基因回路的可靠工具，提供精细调控的基因表达，并可通过更换组织特异性启动子驱动dTALE，实现目标化合物的组织特异性生产。
创新点
首次报道了可被定制dTALE激活的合成启动子文库（STAPs），启动子结构简单，正交性强，表达强度跨度大，可用于植物代谢工程和人工转录网络构建
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 二萜生物合成 | CBTS2a | cembratrienol synthase | 催化 | 催化生成α/β-cembratrienol异构体 |
| Nicotiana benthamiana | MEP途径 | DXS2 | 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase | 催化 | 来自番茄，MEP途径第一步限速酶 |
| Nicotiana benthamiana | MEP途径 | GGPPS2 | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自烟草，催化GGPP合成 |
| Nicotiana benthamiana | 转录调控 | dTALE | designer Transcription Activator-Like Effector | 调控 | 识别EBE002序列，激活STAPs启动子 |
| Nicotiana benthamiana | 报告系统 | GUS | beta-glucuronidase | 催化 | 用于瞬时表达定量分析 |
| Nicotiana benthamiana | 报告系统 | GFP | green fluorescent protein | 催化 | 用于可视化表达 |
关键发现
- 构建了43个测序的STAPs启动子，其表达强度为35S启动子的约5%至近100%
- 在二萜代谢工程中，STAPs驱动的CBTS2a、GGPPS2和DXS2转录水平分别比35S启动子高1.9倍、11.5倍和1.5倍，但CBToI产量约为35S的1/3
- 通过GFP验证了启动子无dTALE时无背景表达
研究结论
STAPs可作为植物代谢工程和合成基因回路的可靠工具，提供可精细调控且正交的基因表达，并可通过更换驱动dTALE的组织特异性启动子实现不同组织中的目标化合物生产