高级醇 · 代谢工程文献库

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Arabidopsis thaliana isoprenyl diphosphate synthases produce the C25 intermediate geranylfarnesyl diphosphate

作者
Raimund Nagel, Carolin Bernholz, Eva Vranová, Ján Kosuth, Nick Bergau, Steve Ludwig, Ludger Wessjohann, Jonathan Gershenzon, Alain Tissier, Axel Schmidt
单位
Department of Biochemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology, Beutenberg Campus, Hans Knoell Straße 8, D-07745 Jena, Germany; Department of Cell and Metabolic Biology, Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, D-06120 Halle (Saale), Germany; Institute of Biology and Ecology, Pavol Jozef Safarik University Kosice, Manesova 23, 04154 Kosice, Slovakia; Department of Bioorganic Chemistry, Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Weinberg 3, D-06120 Halle (Saa), Germany
杂志
The Plant Journal（2015）
DOI
10.1111/tpj.13064
所属领域
代谢工程
关键词
Arabidopsis thalianageranylfarnesyl diphosphategeranylgeranyl diphosphateisoprenyl diphosphate synthaseprenyltransferasesesterterpenesterpenes
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解决的核心问题

拟南芥中已知的异戊烯基二磷酸合酶（IDSs）被注释为牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGDP, C20）合酶，但研究发现其中部分酶实际主要产生牻牛儿基法尼基二磷酸（GFDP, C25），需要重新阐明其真实产物和分子机制。

研究策略

通过异源表达（大肠杆菌）、LC-MS/MS酶活检测、体内过表达（拟南芥）、亚细胞定位（烟草瞬时表达）、序列比对和定点突变等策略，鉴定GFDP合酶活性并揭示产物链长决定机制。

研究路线图

100%
研究问题：已知IDSs被注释为GGDP合酶，实际产生C25 GFDP？
策略：异源表达+LC-MS/MS+体内过表达+亚细胞定位+定点突变
关键改造：FARM基序N端第5位氨基酸（Ser/Ala→Met）改变C25/C20特异性
结果1：5个IDSs（AtIDS1/6/7/9/10）产生C25 GFDP为主产物
结果2：AtIDS9 Km值测定&点突变验证链长决定机制
结果3：亚细胞定位：线粒体/质体小球（与AtPSY共定位）
结果4：体内过表达AtIDS9检出GFDP并出现漂白斑；根中检出GFDP
结论：≥5个IDSs实际产生C25 GFDP，定位于线粒体/质体小球，参与植酯萜类生物合成
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核心内容

该研究通过异源表达、LC-MS/MS酶活检测、体内过表达、亚细胞定位及定点突变等手段，重新鉴定了拟南芥中多个异戊烯基二磷酸合酶的真实催化产物。结果显示，AtIDS1、AtIDS6、AtIDS7、AtIDS9和AtIDS10的主要产物均为C25的牻牛儿基法尼基二磷酸（GFDP）而非先前注释的C20产物，其中AtIDS1产物中GFDP占72.2%，AtIDS6中占比高达94%。定点突变实验表明，FARM基序N端第5位氨基酸残基的大小是决定C25/C20产物特异性的关键，将该位点Ser突变为Met后主要产物转为GGDP。亚细胞定位显示AtIDS1定位于线粒体，其余四个酶定位于质体小球。过表达AtIDS9的拟南芥叶片中检测到GFDP并出现漂白斑，根部也检测到GFDP活性。这些发现首次证明植物中短链异戊烯基二磷酸合酶可产生C25产物，暗示GFDP可能参与植酯萜类化合物的生物合成，为解析植物萜类代谢网络提供了新视角。

创新点

首次报道植物中短链异戊烯基二磷酸合酶能够产生C25的GFDP；发现FARM基序N端第5位氨基酸残基的大小决定C25/C20产物特异性（Met→GGDP，Ser/Ala→GFDP）。

研究对象（7）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS1 AtIDS1 (At1g49530) 催化 主要产物GFDP (72.2%)，次要产物GGDP (25.1%)，定位于线粒体。
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS2 AtIDS2 (At2g18620) 催化 GGDP合酶，主要产物GGDP，微量GDP，无GFDP。
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS6 AtIDS6 (At3g14530) 催化 主要产物GFDP (94%)，定位于质体小球；Ser175突变为Met后产物转向GGDP。
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS7 AtIDS7 (At3g14550) 催化 主要产物GFDP (82%)，定位于质体小球；Ser175突变为Met后产物转向GGDP；与小亚基共表达不影响产物谱。
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS9 AtIDS9 (At3g29430) 催化 主要产物GFDP (90%)，定位于质体小球；测定了各底物Km值；Ser175突变为Met后产物转向GGDP。
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS10 AtIDS10 (At3g32040) 催化 主要产物GFDP (85%)，定位于质体小球；Ser175突变为Met后产物转向GGDP。
A. thaliana 萜类生物合成 AtIDS11 AtIDS11 (At4g36810) 催化 GGDP合酶，定位于质体基质，是主要GGDP合酶；过表达增加GGDP活性。

关键发现

  1. AtIDS1产物分布为GFDP
  2. 2%、GGDP
  3. 1%、GDP
  4. 4%、FDP
  5. 3%；AtIDS6为GFDP 94%、GDP 4%、GGDP 2%；AtIDS7为GFDP 82%、GDP 15%、GGDP 4%；AtIDS9为GFDP 90%、GDP 6%、GGDP 4%；AtIDS10为GFDP 85%、GDP 9%、GGDP 6%。AtIDS9对各底物的表观Km值：DMADP 47 μM, GDP 17 μM, FDP 12 μM, GGDP 14 μM, IDP 11 μM。将AtIDS6/7/9/10的第175位Ser突变为Met后，主要产物变为GGDP，说明该残基是链长决定的关键。过表达AtIDS9的拟南芥叶片中检测到GFDP，并出现漂白斑；过表达AtIDS11则增加GGDP活性。根蛋白提取物能形成GFDP，根中也检测到GFDP存在。亚细胞定位显示AtIDS1定位于线粒体，AtIDS6/7/9/10定位于质体小球（与AtPSY共定位）。AtIDS9的N端42个氨基酸对质体导入必需，但不足以形成亚细胞斑点定位。

研究结论

拟南芥中至少5个异戊烯基二磷酸合酶（AtIDS1、6、7、9、10）产生C25的GFDP而非C20的GGDP作为主要产物，它们定位于线粒体或质体小球。GFDP合酶活性在根中检测到，可能参与植酯萜类（sesterterpenes）的生物合成。FARM基序N端第5位氨基酸残基的大小是决定C25/C20产物链长的关键因素。