Synthetic OCP Heterodimers are Photoactive and Recapitulate the Fusion of Two Primitive Carotenoproteins in the Evolution of Cyanobacterial Photoprotection
- 作者
- Sigal Lechno-Yossef, Matthew R. Melnicki, Han Bao, Beronda L. Montgomery, Cheryl A. Kerfeld
- 单位
- MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University; Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University; Department of Plant and Microbial Biology, University of California; MIBI Division, Lawrence Berkeley National Laboratory
- 杂志
- The Plant Journal（2017）
- DOI
- 10.1111/tpj.13593
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
验证OCP蛋白的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）作为独立多肽时能否相互作用形成有功能的光敏复合物，并探究OCP在蓝藻光保护进化中源于两个原始类胡萝卜素结合蛋白基因融合的假说。
研究策略
利用合成生物学方法将Fremyella diplosiphon的OCP1和OCP2分别拆分表达为带标签的NTD和CTD，在产角黄素（CAN）的大肠杆菌中共表达，通过亲和纯化和SEC分析异二聚体形成、光活性及动力学，同时单独表达CTD研究其类胡萝卜素结合能力。
核心内容
本研究通过合成生物学手段，将蓝藻Fremyella diplosiphon的OCP1和OCP2蛋白分别拆分为独立的N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD），并在产角黄素的大肠杆菌中共表达。研究发现，NTD与CTD无需共价连接即可自发组装为具有光活性的异二聚体，SDS-PAGE显示相应条带为19.5和14.5 kDa。暗态下异二聚体吸收光谱与全长OCP几乎一致，蓝移仅1–2 nm，光照后发生红移并解离为小分子复合物。动力学分析显示NTD1-CTD1光激活半衰期仅0.7分钟，NTD2-CTD2在23°C下暗恢复半衰期为11.1分钟，而嵌合体NTD1-CTD2暗恢复缓慢，2小时可恢复66%。此外，CTD单独表达时可形成结合类胡萝卜素的同二聚体，命名为CCP。这些结果表明类胡萝卜素充当结构“螺栓”稳定复合物，支持OCP由两个祖先类胡萝卜素结合蛋白基因融合进化的假说，也为设计基于OCP的新型光开关提供了可行平台。
创新点
首次证明独立表达的OCP结构域可自发组装成具有光活性的异二聚体，无需共价连接子；发现CTD自身能以同二聚体形式结合类胡萝卜素，命名为CCP；提出OCP进化源于两个祖先类胡萝卜素结合蛋白的基因融合；为基于OCP的光遗传学工具设计提供新平台。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 DE3 | 类胡萝卜素生物合成 | pAC-CANTHipi | 角黄素合成酶 | 能量供给 | 用于产生酮类胡萝卜素CAN的质粒 |
| Fremyella diplosiphon | 光保护 | ocp1 | OCP1 | 调控 | 全长OCP1作为拆分来源 |
| Fremyella diplosiphon | 光保护 | ocp2 | OCP2 | 调控 | 更原始的OCP2旁系同源物 |
| Escherichia coli | 光保护 | ntd1 | NTD1 (N-terminal domain of OCP1) | 催化 | OCP1的N端效应结构域，带StrepTag，负责光保护效应 |
| Escherichia coli | 光保护 | ctd1 | CTD1 (C-terminal domain of OCP1) | 调控 | OCP1的C端调控结构域，带HisTag |
| Escherichia coli | 光保护 | ntd2 | NTD2 (N-terminal domain of OCP2) | 催化 | OCP2的N端效应结构域，带StrepTag |
| Escherichia coli | 光保护 | ctd2 | CTD2 (C-terminal domain of OCP2) | 调控 | OCP2的C端调控结构域，带HisTag |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素结合 | ctd1 | CTD1-CAN复合物 | 转运 | 单独表达CTD1结合CAN形成CCP1 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素结合 | ctd2 | CTD2-CAN复合物 | 转运 | 单独表达CTD2结合CAN形成CCP2，SEC证明色素结合在二聚体中 |
| Escherichia coli | 光保护 | ntd1-ctd2 | 嵌合异二聚体NTD1-CTD2 | 调控 | 具有中间光激活和暗恢复特性 |
关键发现
- 在产CAN的大肠杆菌中，NTD1-CTD1和NTD2-CTD2异二聚体可形成橙色复合物，SDS-PAGE显示条带为19.5和14.5 kDa
- 无CAN时无相互作用。CTD1-CAN和CTD2-CAN吸收光谱半峰宽分别为140 nm和141 nm，CTD2-CAN色素只在二聚体中。NTD1-CTD1和NTD2-CTD2暗态吸收峰与全长OCP几乎相同，蓝移仅2 nm和1 nm
- 光激活后红移4 nm和7 nm。SEC分析暗态下NTD2-CTD2大小为38 kDa，NTD1-CTD1为58 kDa
- 光照后解离为21和23 kDa。NTD1-CTD1光激活T1/2为0.7 min（23°C和15°C），NTD2-CTD2在15°C为2.9 min，23°C为1.7 min但仅转化60%
- NTD2-CTD2暗恢复T1/2在23°C为11.1 min，15°C为20.8 min
- NTD1-CTD1无暗恢复。嵌合体NTD1-CTD2光激活T1/2为1.5 min，暗恢复T1/2为72 min，2小时恢复66%。
研究结论
OCP的NTD和CTD可独立组装成有功能的光敏异二聚体，类胡萝卜素是结构'螺栓'，光驱动解离和重关联动力学因OCP亚型而异；CTD作为NTF2样超家族成员能结合类胡萝卜素，支持OCP由两个原始类胡萝卜素结合蛋白融合进化的假说，并为设计新型光开关提供基础。