CYP76BK1 orthologs catalyze furan and lactone ring formation in cleroane diterpenoids across the mint family
- 作者
- Nicholas J. Schlecht, Emily R. Lanier, Trine B. Andersen, Julia Brose, Daniel Holmes, Bjorn R. Hamberger
- 单位
- Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University; DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Michigan State University; Department of Plant Biology, Michigan State University; Department of Chemistry, Michigan State University
- 杂志
- The Plant Journal（2024）
- DOI
- 10.1111/tpj.17031
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析唇形科植物中呋喃克罗烷二萜（furanoclerodanes）生物合成中关键的氧化环化步骤，揭示催化呋喃环和内酯环形成的细胞色素P450酶（CYP76BK1直系同源物）及其功能保守性与进化起源。
研究策略
结合转录组/基因组挖掘、系统发育分析、烟草瞬时表达、GC-MS/NMR产物结构鉴定、染色体规模基因组共线性分析等方法，从多种唇形科植物中鉴定CYP76BK1直系同源物并表征其催化功能，探索其进化历史。
核心内容
该研究系统解析了唇形科植物中呋喃克罗烷二萜生物合成的关键氧化环化步骤。研究者结合转录组与基因组挖掘、系统发育分析、烟草瞬时表达及产物结构鉴定等手段，在6个唇形科亚科中鉴定到10个CYP76BK1直系同源物，并证实这些酶不仅能催化呋喃环形成，还能催化生成C15和C16两种新型内酯环。异源表达显示所有CYP76BK1均能形成呋喃环，其中HsCYP76BK1对kolavenol的转化活性最高，SbCYP76BK1则生成产量最高的C15内酯。染色体规模共线性分析发现CYP76BK1在唇形科中形成保守共线基因区块，表明其起源早于主要亚科的分化。数据库挖掘显示呋喃克罗烷数量比呋喃拉丹烷多5倍以上，且约40%的已报道呋喃克罗烷来自含有CYP76BK1直系同源物的物种，其分布与化合物积累高度吻合。研究还发现CYP76BK1与鼠尾草中的CYP76AH39功能趋同进化。该结果为理解呋喃环与内酯环形成的多次氧化及自发重排机制提供了依据，也为利用合成生物学手段可持续生产这类高价值二萜化合物奠定了基础。
创新点
首次在6个唇形科亚科中鉴定到10个CYP76BK1直系同源物；揭示这些酶除催化呋喃环形成外，还能催化形成两种新型内酯环（C15和C16内酯）；发现CYP76BK1在唇形科中形成保守的共线基因区块，表明其起源早于唇形科主要亚科的分化；提出包含多次氧化和自发重排的呋喃/内酯环形成机制。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 呋喃克罗烷二萜生物合成 | ArCYP76BK1 | CYP76BK1 (Ajuga reptans) | 催化 | 催化isokaleanol氧化环化形成呋喃环产物1，低活性形成内酯产物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 呋喃克罗烷二萜生物合成 | CamCYP76BK1 | CYP76BK1 (Callicarpa americana) | 催化 | 催化kolavenol形成呋喃环产物2及少量内酯产物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 呋喃克罗烷二萜生物合成 | CYP76BK1 orthologs (Cp, Pb, Hs, Sb, Cb, Tca, Tch等) | CYP76BK1直系同源物 | 催化 | 所有直系同源物均催化呋喃环形成，部分产生C15或C16内酯；底物偏好性和产物比例存在差异 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜前体生物合成 | CamTPS2 / ArTPS2 | 二萜合酶 (kolavenyl/isokolavenyl diphosphate synthase) | 催化 | 分别产生kolavenol和isokaleanol的前体，为CYP76BK1提供底物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | MEP途径（上游前体供给） | PbDXS, PbGGPPS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 共表达以增强二萜前体产量，提高下游产物积累 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 呋喃拉丹烷二萜生物合成 | VacCYP76BK1 | CYP76BK1 (Vitex agnus-castus) | 催化 | 先前已知其催化peregrinol C16羟基化，本研究发现其也能在克罗烷底物上形成呋喃/内酯环 |
关键发现
- DNP数据库挖掘显示呋喃克罗烷主要存在于唇形科，其数量比呋喃拉丹烷多5倍以上
- A. reptans和C. americana中的CYP76BK1直系同源物（ArCYP76BK1与CamCYP76BK1）能催化isokaleanol和kolavenol的氧化环化形成呋喃环产物（15,16-环氧-4,18,16),14-克罗地三烯和15,16-环氧-3,13(16),14-克罗地三烯）
- 共发现10个CYP76BK1直系同源物跨越6个亚科，其中4个（C. americana, C. inerme, S. baicalensis, S. barbata）在保守共线区块中作为syntelogs存在
- 异源表达显示所有CYP76BK1均能形成呋喃环，部分还能生成C15或C16内酯，其中HsCYP76BK1对kolavenol转化为呋喃产物活性最高，CbCYP76BK1对isokolavenol活性最高并生成大量C16内酯（4），SbCYP76BK1产量最高的C15内酯（6）
- 约40%的已报道呋喃克罗烷来自含有CYP76BK1直系同源物的物种
- CYP76BK1与CYP76AH39（Salvia）在功能上趋同进化。
研究结论
CYP76BK1直系同源物是唇形科中呋喃克罗烷生物合成的关键酶，其功能在多个亚科中保守，且其分布与呋喃克罗烷的积累模式高度吻合。这些酶催化形成呋喃环和两种内酯环，为呋喃克罗烷的结构多样性提供了基础。研究结果为利用生物技术手段可持续生产这些高价值化合物奠定了基础。