The biosynthesis of the anti-microbial diterpenoid leuethanol in Leucophyllum frutescens proceeds via an all-cis prenyl intermediate
- 作者
- Garret P. Miller, Wajeed Waheed Bhat, Emily R. Lanier, Sean R. Johnson, Davis T. Mathieu, Bjorn Hamberger
- 单位
- Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI, USA
- 杂志
- The Plant Journal（2020）
- DOI
- 10.1111/tpj.14957
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明抗微生物二萜leuethanol在Leucophyllum frutescens中的生物合成途径，特别是非典型全顺式前体NNPP的参与及其酶学机制。
研究策略
利用组织特异性转录组比较（根/花）与跨属比较（与Eremophila serrulata），通过同源搜索和系统发育分析筛选候选基因，在烟草（Nicotiana benthamiana）和大肠杆菌中异源表达，结合体外酶活验证、GC-MS和NMR鉴定产物，最终重构完整通路。
核心内容
该研究首次阐明了白花树（Leucophyllum frutescens）中抗微生物二萜leuethanol的完整生物合成途径。通过组织特异性转录组比较与跨属系统发育分析，研究者筛选并鉴定了三个关键酶：短链顺式异戊烯基转移酶LfCPT1负责合成非典型全顺式前体NNPP，萜烯合酶LfTPS1（归属TPS-a亚家族）专一性地将NNPP环化为dihydroserrulatene及其自发芳构化产物serrulatane，细胞色素P450酶CYP71D616则催化C8位羟基化生成终产物leuethanol。在烟草中异源共表达这三个酶可成功重构该通路，产物与根提取物一致。研究发现LfTPS1与亲缘属植物Eremophila serrulata中的同源酶具有85%的氨基酸同一性，表明该途径在富含serrulatane的类群中功能保守。值得注意的是，leuethanol对多药耐药结核分枝杆菌的最低抑菌浓度为22 μM，与一线药物异烟肼（23 μM）相当。该工作为复杂serrulatane型二萜的异源生产与结构多样化奠定了基础。
创新点
首次阐明serrulatane二萜生物合成途径；发现植物中短链顺式异戊烯基转移酶LfCPT1产生NNPP；鉴定LfTPS1为专一利用NNPP的TPS-a亚家族酶，代表区室转换和新功能化；鉴定CYP71D616催化骨架羟化；在烟草中实现异源全合成。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Leucophyllum frutescens | 二萜生物合成（serrulatane型） | LfCPT1 | LfCPT1 | 催化 | 短链顺式异戊烯基转移酶，催化DMAPP与IPP缩合产生NNPP；在N. benthamiana和E. coli中异源表达验证功能 |
| Leucophyllum frutescens | 二萜生物合成（serrulatane型） | LfTPS1 | LfTPS1 | 催化 | 质体定位的TPS-a亚家族萜烯合酶，专一利用NNPP环化生成dihydroserrulatene和serrulatane；在N. benthamiana和E. coli中异源表达验证功能 |
| Leucophyllum frutescens | 二萜生物合成（serrulatane型） | CYP71D616 | CYP71D616 | 催化 | CYP71家族细胞色素P450，催化dihydroserrulatene C8位羟化生成leuethanol；在N. benthamiana中异源表达验证功能 |
关键发现
解析了leuethanol完整生物合成途径，涉及三个酶：LfCPT1合成NNPP，LfTPS1将NNPP环化为dihydroserrulatene（主要产物1）及自发芳构化的serrulatane（2），CYP71D616催化C8羟基化生成leuethanol。在N. benthamiana中重构全部三个酶可产生leuethanol，产物与L. frutescens根提取物一致。LfTPS1与Eremophila同源酶EsTPS1有85%氨基酸同一性，功能保守。leuethanol对多药耐药结核分枝杆菌的最低抑菌浓度为22 μM，与异烟肼（23 μM）和乙胺丁醇（39 μM）相当。短链cis-PT此前仅在茄科植物中发现，本研究首次在玄参科中证实其存在。
研究结论
leuethanol的生物合成由LfCPT1（NNPP合成）、LfTPS1（环化形成serrulatane骨架）和CYP71D616（羟化）三步组成，该途径在富含serrulatane的Eremophila属中保守。本研究为复杂serrulatane二萜的异源生产和多样化提供了平台。