Transformation of the Green Alga Haematococcus pluvialis with a Phytoene Desaturase for Accelerated Astaxanthin Biosynthesis
- 作者
- Jens Steinbrenner, Gerhard Sandmann
- 单位
- Department of Plant Physiology and Biochemistry, Universität Konstanz, D-78434 Konstanz, Germany; Institute for Molecular Biosciences 213, J. W. Goethe Universität, P.O. Box 111932, D-60054 Frankfurt/Main, Germany
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2006）
- DOI
- 10.1128/AEM.01461-06
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)的稳定核遗传转化系统，并通过工程化八氢番茄红素脱氢酶(Pds)加速虾青素的生物合成。
研究策略
从H. pluvialis中分离pds基因，通过定点突变将第504位亮氨酸突变为精氨酸，获得抗除草剂norflurazon的突变体pds-L504R；利用该突变基因作为显性选择标记和报告基因，通过基因枪介导的生物弹道转化导入H. pluvialis，在含norflurazon的培养基上筛选稳定转化子，并通过分子生物学和生化分析验证转化及类胡萝卜素合成变化。
核心内容
该研究开发了一种基于内源突变基因的雨生红球藻稳定核遗传转化系统，并通过工程化八氢番茄红素脱氢酶（Pds）加速虾青素生物合成。研究人员从雨生红球藻中分离pds基因，通过定点突变将第504位亮氨酸替换为精氨酸，获得抗除草剂norflurazon的突变体Pds-L504R，其体外抑制常数Ki从野生型的0.14 μM增至5.98 μM，抗性提高43倍且保持催化活性。利用该突变基因作为显性选择标记，通过基因枪生物弹道法转化雨生红球藻，在含norflurazon的培养基上筛选出稳定转化子，并建立基于叶绿素荧光NPQ检测的筛选方法。转化子P3和P11在强光1小时后总类胡萝卜素含量分别达2.65和3.00 mg/g干重，高于野生型的2.35 mg/g；连续高光48小时后，P3的虾青素含量达11.4 mg/g干重，比野生型高26%，NPQ最大值约为野生型的两倍。经20周非选择培养后70%转化子仍保持抗性。该工作首次在雨生红球藻中实现类胡萝卜素途径的定向遗传改造，为利用该藻高效生产虾青素提供了概念验证。
创新点
首次在H. pluvialis中建立了基于内源突变pds基因的显性选择标记转化系统；突变后的Pds-L504R对norflurazon的抗性比野生型高43倍；利用该转化系统实现了类胡萝卜素途径的定向遗传改造，加速了虾青素的积累，并建立了基于叶绿素荧光NPQ检测的转化子筛选方法。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Haematococcus pluvialis | 类胡萝卜素生物合成途径 | — | — | — | 底盘生物，单细胞绿藻，能积累高水平的虾青素 |
| — | 类胡萝卜素生物合成途径 | pds | Pds | 催化 | 野生型八氢番茄红素脱氢酶，催化八氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素 |
| — | 类胡萝卜素生物合成途径 | pds-L504R | Pds-L504R | 催化 | 第504位亮氨酸突变为精氨酸的突变体，对除草剂norflurazon抗性提高43倍 |
关键发现
- 突变的Pds-L504R仍具催化活性，体外抑制常数Ki从野生型的0.14 μM增加到5.98 μM，抗性提高43倍
- 基因枪转化效率约为10^-6细胞/μg DNA
- 11个转化子中确认了pds-L504R整合到核基因组，且多数转化子有额外拷贝
- 转化子P3和P11在强光1小时后的总类胡萝卜素含量分别为2.65±0.30和3.00±0.28 mg/g干重，高于野生型的2.35±0.24 mg/g
- 其中叶黄素、玉米黄质和β-胡萝卜素显著增加
- 在连续高光48小时后，转化子P3的虾青素含量达11.4±0.9 mg/g干重，比野生型(8.6±1.4 mg/g)高26%，而P11为8.4±1.6 mg/g
- 转化子P3和P11的NPQ最大值约为野生型(0.38)的两倍
- 经过20周（约80代）非选择培养后，70%的转化子仍保持norflurazon抗性。
研究结论
工程化的pds-L504R基因可作为H. pluvialis稳定核转化的显性选择性标记和报告基因，增加Pds活性可提高类胡萝卜素合成并加速虾青素积累，这是H. pluvialis类胡萝卜素途径遗传改造的首个概念验证。