Functional Assembly of Minicellulosomes on the Saccharomyces cerevisiae Cell Surface for Cellulose Hydrolysis and Ethanol Production
- 作者
- Shen-Long Tsai, Jeongseok Oh, Shailendra Singh, Ruizhen Chen, Wilfred Chen
- 单位
- Department of Chemical and Environmental Engineering, University of California at Riverside; School of Chemical and Biomolecular Engineering, Georgia Institute of Technology
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2009）
- DOI
- 10.1128/AEM.01538-09
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母细胞表面功能性组装微型纤维小体，解决纤维素水解与乙醇发酵一体化（CBP）的问题。
研究策略
利用酵母表面展示技术，将含三个不同cohesin域和CBD的脚手架蛋白展示在细胞表面，再通过cohesin-dockerin特异性结合，将三种纤维素酶（内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶）组装成功能性微型纤维小体，实现协同水解和直接发酵。
核心内容
该研究在酿酒酵母细胞表面实现了微型纤维小体的功能性组装，以解决纤维素水解与乙醇发酵一体化问题。研究者利用酵母表面展示技术，将包含三个不同物种来源cohesin域及纤维素结合域的脚手架蛋白Scaf-ctf锚定于细胞表面，再通过cohesin-dockerin的特异性识别，将分别来自热纤维梭菌、解纤维素梭菌和生黄瘤胃球菌的内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶组装为协同作用的酶复合体。结果显示，三种酶组装后的Avicel水解协同度由单一酶的1.62倍提升至2.44倍；当以BglA替换其中一种酶后，工程菌株在48小时内可从无定形纤维素直接发酵产生3.5 g/L乙醇，为等量游离酶体系的2.6倍，乙醇产率达理论值的95%。发酵过程中葡萄糖未积累，说明生成的糖被迅速利用。该工作首次证明在酵母表面组装含三种不同dockerin-cohesin对的微型纤维小体可行，为构建高效纤维素整合生物加工微生物提供了有效策略。
创新点
首次在酿酒酵母表面成功组装包含三种不同dockerin-cohesin对的微型纤维小体；证明了表面展示的微型纤维小体具有协同效应，并可直接从无定形纤维素发酵乙醇，产率达到理论值的95%。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素乙醇发酵 | scaffoldin基因（构建于pCTCON2载体） | Scaf-ctf（三价脚手架蛋白） | 区室化 | 含来自C. thermocellum、C. cellulolyticum和R. flavefaciens的三个cohesin域及一个CBD，通过GPI锚定展示于酵母细胞表面，用于组织多个催化酶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 纤维素降解 | celA | CelA-Dockerin融合蛋白（At） | 催化 | 内切葡聚糖酶CelA，来自C. thermocellum，融合其天然dockerin域，可被Scaf-ctf上的C. thermocellum cohesin识别 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 纤维素降解 | celE | CelE-Dockerin融合蛋白（Ec） | 催化 | 外切葡聚糖酶CelE，来自C. cellulolyticum，融合其天然dockerin域，可被Scaf-ctf上的C. cellulolyticum cohesin识别 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 纤维素降解 | celG | CelG-Dockerin融合蛋白（Gf） | 催化 | 内切葡聚糖酶CelG，来自C. cellulolyticum，融合R. flavefaciens的dockerin域，可被Scaf-ctf上的R. flavefaciens cohesin识别 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 纤维素降解 | bglA | BglA-Dockerin融合蛋白（BglA） | 催化 | β-葡萄糖苷酶BglA，来自C. thermocellum，融合R. flavefaciens的dockerin域，用于将纤维二糖等转化为葡萄糖 |
关键发现
['在酿酒酵母表面成功展示了含三个cohesin域（分别来自Clostridium thermocellum、Clostridium cellulolyticum和Ruminococcus flavefaciens）的脚手架蛋白Scaf-ctf，并能与E. coli细胞裂解液中的对应dockerin融合纤维素酶特异性组装。', '当三种纤维素酶（At、Ec、Gf）组装在Scaf-ctf上时，Avicel水解协同度从单个酶的1.62倍提高到三个酶的2.44倍（与等量游离酶相比）。', '用BglA替换Gf后，展示At+Ec+BglA的酵母菌株在48小时内从PASC直接发酵乙醇，最终乙醇浓度达3.5 g/L，是添加等量游离酶的2.6倍。', '乙醇产率为0.49 g乙醇/g消耗糖，相当于理论值的95%。', '发酵过程中葡萄糖浓度低于检测限，表明生成的葡萄糖被迅速利用，未积累。', '在PASC水解中，加入Ec使葡萄糖产量提高3倍，而β-葡萄糖苷酶BglA进一步提高了葡萄糖释放速率。']
研究结论
研究表明，将包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的微型纤维小体组装在酵母细胞表面是可行的，该工程菌株能高效地将纤维素直接发酵为乙醇，具有作为CBP微生物的潜力。