Phylogenetic and Kinetic Characterization of a Suite of Dehydrogenases from a Newly Isolated Bacterium, Strain SG61-1L, That Catalyze the Turnover of Guaiacylglycerol-β-Guaiacyl Ether Stereoisomers
- 作者
- Shannu Palamuru, Nikki Dellas, Stephen L. Pearce, Andrew C. Warden, John G. Oakeshott, Gunjan Pandey
- 单位
- CSIRO Land & Water Flagship, Acton, ACT, Australia; Research School of Chemistry, Australian National University, Acton, ACT, Australia
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2015）
- DOI
- 10.1128/AEM.01573-15
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
新分离菌株SG61-1L能快速降解木质素模型化合物GGE，但其分子机制尚不清楚，特别是催化第一步氧化反应的脱氢酶的种类和动力学特性。
研究策略
通过富集培养从造纸厂废水中分离GGE降解菌SG61-1L，进行全基因组测序，基于序列同源性和基因组上下文筛选候选脱氢酶基因，异源表达并纯化，测定各酶对四个GGE立体异构体的动力学参数，构建系统发育树分析进化关系。
核心内容
研究从造纸厂废水中富集分离出一株能快速降解木质素模型化合物愈创木基甘油-β-愈创木基醚（GGE）的新菌株SG61-1L，并对其降解GGE的脱氢酶进行了系统鉴定。通过全基因组测序和序列同源性筛选，从该菌株中克隆了六种候选脱氢酶基因，在大肠杆菌中异源表达纯化后，测定了这些酶对GGE四个立体异构体的动力学参数，并与已知的Sphingobium sp. SYK-6菌株的LigD、LigO、LigL和LigN酶进行了比较。结果显示，SG61-1L在75小时内可完全降解200 μM GGE，而SYK-6需要160小时以上。其中，724酶对(αR,βS)-GGE和(αR,βR)-GGE表现出极高的催化效率，kcat/Km分别为360和368 μM⁻¹ s⁻¹，其kcat高达701和1534 s⁻¹，比SYK-6对应酶高出最多550倍；2550酶则对(αS,βR)-GGE和(αS,βS)-GGE具有优异的底物亲和力。系统发育分析表明这些GGE脱氢酶构成一个独立进化枝，但酶的立体选择性与序列亲缘关系并不对应。该研究揭示了SG61-1L快速降解GGE的分子基础，其724和2550酶凭借优越的催化性能可作为木质素降解工业应用的候选酶，同时也为理解脱氢酶的立体选择性机制提供了新线索。
创新点
鉴定了一个新的GGE脱氢酶进化枝；发现SG61-1L的724和2550酶比SYK-6已知酶具有更高的催化效率（kcat最高达550倍）；揭示了脱氢酶立体选择性的多样性，为木质素降解的应用提供了多种酶选择。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sphingobium sp. SYK-6 | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | ligD | LigD | 催化 | Cα-脱氢酶，氧化GGE为MPHPV；对(αS,βR)-GGE Km最低(0.39 μM)。 |
| Sphingobium sp. SYK-6 | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | ligO | LigO | 催化 | Cα-脱氢酶，对(αS,βS)-GGE kcat最高(15.6 s^-1)。 |
| Sphingobium sp. SYK-6 | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | ligL | LigL | 催化 | Cα-脱氢酶，对(αS,βS)-GGE kcat达381 s^-1。 |
| Sphingobium sp. SYK-6 | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | ligN | LigN | 催化 | Cα-脱氢酶，能氧化所有四种立体异构体。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_15290 | 724 | 催化 | Cα-脱氢酶，kcat最高达1534 s^-1，对(αR,βS)-GGE和(αR,βR)-GGE的kcat/Km约360-368 μM^-1 s^-1。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_00030 | 2550 | 催化 | Cα-脱氢酶，对(αS,βR)-GGE和(αS,βS)-GGE的Km分别3.6和0.8 μM。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_12360 | 3329 | 催化 | Cα-脱氢酶，仅对(αR,βR)-GGE和(αS,βS)-GGE有活性，kcat较低。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_01645 | 2705 | 催化 | Cα-脱氢酶，对(αS,βR)-GGE和(αS,βS)-GGE有活性，对(αR,βS)-GGE活性低。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_05225 | 1498 | 催化 | Cα-脱氢酶，仅能氧化(αS,βR)-GGE和(αS,βS)-GGE。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_12435 | 3344 | 催化 | Cα-脱氢酶，与SYK-6序列相似度低，但能氧化多个GGE立体异构体。 |
| strain SG61-1L | GGE降解通路（β-O-4芳基醚降解） | S62_16365 | 474 | 催化 | Cα-脱氢酶，与SYK-6序列相似度低，但能氧化两个GGE立体异构体。 |
关键发现
- SG61-1L在75小时内完全降解200μM GGE，而SYK-6需要160小时以上
- SG61-1L的724酶对(αR,βS)-GGE和(αR,βR)-GGE的kcat/Km分别为360和368 μM^-1 s^-1，kcat分别达701和1534 s^-1
- 2550酶对(αS,βR)-GGE和(αS,βS)-GGE的Km分别为3.6和0.8 μM，kcat/Km分别为12.9和95.1 μM^-1 s^-1
- 724的kcat比SYK-6酶高550倍。
研究结论
SG61-1L是快速降解GGE的细菌，其编码的脱氢酶特别是724和2550具有优越的催化性能，可作为木质素降解工业应用的候选酶；系统发育分析表明GGE脱氢酶形成一个独立进化枝，且立体选择性与序列关系不明确，需要结构生物学进一步研究。