Resistance of Saccharomyces cerevisiae to High Concentrations of Furfural Is Based on NADPH-Dependent Reduction by at Least Two Oxireductases
- 作者
- Dominik Heer, Daniel Heine, Uwe Sauer
- 单位
- ETH Zurich, Institute of Molecular Systems Biology, Wolfgang-Pauli-Strasse 16, 8093 Zurich, Switzerland
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2009）
- DOI
- 10.1128/AEM.01649-09
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明酿酒酵母对高浓度糠醛（木质纤维素水解液中的关键毒性化合物）的天然耐受及进化获得的高水平耐受的分子机制，特别是还原糠醛所需的辅因子来源及关键酶。
研究策略
采用微好氧、葡萄糖限制的恒化培养，比较糠醛进化适应菌株TMB3400-FT30-3与其亲本TMB3400在不同糠醛浓度（15、25、36 mM）下的生理参数、13C标记代谢通量分析和全基因组转录谱，并通过反向代谢工程在亲本中过表达关键基因进行功能验证。
核心内容
该研究通过微好氧、葡萄糖限制的恒化培养体系，系统比较了糠醛进化适应菌株TMB3400-FT30-3与其亲本TMB3400在不同糠醛浓度下的生理、代谢通量及转录响应，阐明了酿酒酵母对高浓度糠醛耐受的分子机制。结果表明，在15 mM糠醛下NADH依赖还原酶足以完成解毒，而25 mM及以上时NADPH依赖还原成为主导，进化菌株通过上调磷酸戊糖途径提供NADPH，其PPP比例从15 mM时的0.08升至36 mM时的0.33，糠醛还原速率相应从2.0增至6.0 mmol gdw-1 h-1，并在36 mM下维持稳态而亲本被洗出。通过反向代谢工程验证，过表达ADH7或YKL071W可将亲本在11 mM糠醛中的延迟期缩短约30%，进化菌株则缩短80%；四分体分析显示抗性主要由单一遗传改变决定。该工作明确了NADPH依赖氧化还原酶及磷酸戊糖途径在糠醛耐受中的核心作用，为木质纤维素水解液发酵菌株的理性改造提供了明确靶点。
创新点
1. 利用恒化培养建立稳定生长状态，避免糠醛导致的生长抑制对代谢和转录的间接影响；2. 结合13C通量分析定量证明在>15 mM糠醛时磷酸戊糖途径通量上调以提供NADPH；3. 鉴定并验证ADH7和YKL071W是糠醛还原的关键NADPH依赖氧化还原酶。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | ADH7 | Adh7p | 催化 | NADPH依赖的醇脱氢酶，过表达使糠醛延迟期缩短约30% |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | YKL071W | Ykl071wp | 催化 | 未知功能，同源于羰基还原酶，过表达使糠醛延迟期缩短约30% |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | GRE2 | Gre2p | 催化 | NADPH依赖的氧化还原酶，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | OYE2 | Oye2p | 催化 | NADPH依赖的氧化还原酶，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | OYE3 | Oye3p | 催化 | NADPH依赖的氧化还原酶，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | YML131W | Yml131wp | 催化 | NADPH依赖的氧化还原酶，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | YDL124W | Ydl124wp | 催化 | NADPH依赖的氧化还原酶，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | AAD4 | Aad4p | 催化 | 氧化还原酶，辅因子偏好未知，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | GCY1 | Gcy1p | 催化 | NADPH依赖的氧化还原酶，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 氧化还原代谢 | YLL056C | Yll056cp | 催化 | 预测为NADH依赖的脱氢酶，含有NAD(P)H结合位点，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | ZWF1 | Zwf1p | 催化 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，NADPH生成关键酶，在36 mM糠醛下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | GND1 | Gnd1p | 催化 | 6-磷酸葡糖酸脱氢酶，NADPH生成关键酶，在36 mM糠醛下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | SOL3 | Sol3p | 催化 | 6-磷酸葡糖酸内酯酶，参与戊糖磷酸途径，在36 mM糠醛下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 戊糖磷酸途径 | TKL1 | Tkl1p | 催化 | 转酮醇酶，参与戊糖磷酸途径，在36 mM糠醛下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铁离子转运 | FIT2 | Fit2p | 转运 | 铁转运相关蛋白，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铁离子转运 | FIT3 | Fit3p | 转运 | 铁转运相关蛋白，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铁离子转运 | SIT1 | Sit1p | 转运 | 铁载体跨膜转运蛋白，在糠醛胁迫下转录上调 |
| Saccharomyces cerevisiae | 铁离子转运 | ARN1 | Arn1p | 转运 | 铁载体跨膜转运蛋白，在糠醛胁迫下转录上调 |
关键发现
- 在15 mM糠醛下，NADH依赖的氧化还原酶足以完成糠醛还原
- 在25和36 mM糠醛下，NADPH依赖的还原成为主导，磷酸戊糖途径丝氨酸来源比例（PPP比例）在进化菌株中从15 mM时的0.08升至36 mM时的0.33（亲本在25 mM时为0.18）。进化菌株可在36 mM糠醛下维持稳态，亲本则被洗出。糠醇生成速率（糠醛还原速率）在进化菌株中从15 mM的2.0±0.1 mmol gdw-1 h-1增至36 mM的6.0±1.2 mmol gdw-1 h-1
- 亲本在25 mM时为3.1±0.6。过表达ADH7或YKL071W使亲本在11 mM糠醛中的延迟期缩短约30%，而进化菌株缩短约80%。四分体分析显示16/17的孢子呈现2:2分离，表明抗性由一个主要遗传改变决定。
研究结论
酿酒酵母对高浓度糠醛的抗性至少部分依赖于NADPH依赖的氧化还原酶（ADH7和YKL071W）催化的糠醛还原，伴随戊糖磷酸途径通量增加以提供NADPH；铁跨膜转运的上调可能也是抗性的一部分。