Novel Activity of Rhodobacter sphaeroides Spheroïdene Monooxygenase CrtA Expressed in Escherichia coli
- 作者
- Pyung Cheon Lee, Erik Holtzapple, Claudia Schmidt-Dannert
- 单位
- Department of Molecular Science and Technology and Department of Biotechnology, Ajou University; Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1128/AEM.01606-10
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究Rhodobacter sphaeroides的螺菌黄质单加氧酶CrtA在大肠杆菌中表达时对非天然底物的新型催化活性，并确定其是否为P450酶。
研究策略
在大肠杆菌中共表达CrtA与类胡萝卜素合成基因（crtE、crtB、crtI或crtI14），分离鉴定产生的氧化类胡萝卜素；纯化CrtA并进行光谱分析以研究其活性位点。
核心内容
该研究在大肠杆菌中表达了来自类球红细菌的螺菌黄质单加氧酶CrtA，并考察其对非天然底物的催化活性。通过将CrtA与类胡萝卜素合成基因crtE、crtB及crtI或crtI14共表达，分离鉴定了多种氧化类胡萝卜素，其中三种新产物T2（m/z 564.4）、D1（m/z 566.4）和T3（m/z 582.4）分别被推测为1-OH-四脱氢番茄红素-2-酮、1-OH-二脱氢番茄红素-2-酮和1,1'-(OH)2-四脱氢番茄红素-2-酮，表明CrtA能在无环类胡萝卜素两端引入羟基和酮基，共鉴定出13种氧化产物，m/z范围为548至598。纯化后的CrtA光谱分析显示，加入咪唑后Soret峰从404 nm移至414 nm，加入连二亚硫酸盐后移至420 nm，但加入CO后峰位置不变，与P450-BM3对照形成鲜明对比，证明CrtA并非P450酶，而是一种含5配位血红素的新型加氧酶。该发现揭示CrtA具有独特的催化灵活性，可用于生物技术生产多样化氧化类胡萝卜素，拓展了类胡萝卜素功能化修饰的工具箱。
创新点
发现CrtA能在非天然无环类胡萝卜素两端引入羟基和酮基，产生多种新型氧化类胡萝卜素；通过光谱学证据表明CrtA不是P450酶，而是一种含5配位血红素的新型加氧酶。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtA | Spheroidene monooxygenase CrtA | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides，在大肠杆菌中异源表达，催化非天然底物引入羟基和酮基 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 提供类胡萝卜素合成前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 引入脱氢，产生不同饱和度底物如番茄红素等 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI14 | 八氢番茄红素脱氢酶突变体 | 催化 | 突变体，产生四脱氢番茄红素等更多不饱和底物 |
关键发现
- 从大肠杆菌(pAC-CrtECrtBCrtI14, pUC-CrtA)中分离出3种新的氧化类胡萝卜素T2 ([M+]=564.4)、D1 ([M+]=566.4)和T3 ([M+]=582.4)，推测为1-OH-四脱氢番茄红素-2-酮、1-OH-二脱氢番茄红素-2-酮和1,1'-(OH)2-四脱氢番茄红素-2-酮
- 此外还鉴定出N1-N4、L1-L3、D1-D4、T1-T4等共13种氧化类胡萝卜素，m/z范围548-598。纯化的CrtA在加入咪唑后Soret峰从404 nm移至414 nm，加入连二亚硫酸盐后移至420 nm，但加入CO后峰不移动（对照组P450-BM3出现典型的450 nm吸收峰），表明CrtA不是P450酶。培养条件为28°C、24-36小时，氨苄青霉素100 μg/ml和氯霉素50 μg/ml。
研究结论
CrtA是一种具有独特催化活性的新型加氧酶，可在大肠杆菌中向非天然底物引入羟基和酮基，可用于生物技术生产更多样化的氧化类胡萝卜素。