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Effects of Trichothecene Production on the Plant Defense Response and Fungal Physiology: Overexpression of the Trichoderma arundinaceum tri4 Gene in T. harzianum

作者
R. E. Cardoza, S. P. McCormick, M. G. Malmierca, E. R. Olivera, N. J. Alexander, E. Monte, S. Gutiérrez
单位
Area of Microbiology, University School of Agricultural Engineers, University of León, Campus de Ponferrada, Ponferrada, Spain; Bacterial Foodborne Pathogen and Mycology Unit, USDA/ARS, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, USA; Area of Biochemistry and Molecular Biology, University of León, Campus de Ponferrada, Ponferrada, Spain; Spanish-Portuguese Centre of Agricultural Research (CIALE), Department of Microbiology and Genetics, University of Salamanca, Salamanca, Spain
杂志
Applied and Environmental Microbiology（2015）
DOI
10.1128/AEM.01626-15
所属领域
农业微生物学 / 植物病原互作 / 真菌代谢工程
关键词
EPTTrichodermaantifungal activityphytotoxicityplant defensetri4trichothecene
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解决的核心问题

探究单端孢霉烯（trichothecene）中间产物12,13-epoxytrichothec-9-ene（EPT）对植物防御反应和真菌生理的影响，并解析不同结构中间体的生物活性差异。

研究策略

将 Trichoderma arundinaceum 的 tri4 基因异源表达于已含 tri5 的 Trichoderma harzianum T34-5.27 菌株，构建产 EPT 的工程菌；用纯化 EPT、trichodermol 和哈茨木霉素（HA）处理番茄，比较其植物毒性和防御基因表达；分析 EPT 对 Botrytis cinerea 的拮抗作用、对番茄根定殖的影响，并检测萜烯/麦角甾醇代谢相关基因表达。

研究路线图

100%
研究问题：单端孢霉烯中间体EPT在植物-真菌互作中的功能与毒性机制
策略：构建tri4异源表达工程菌产EPT，并用纯化中间体处理番茄比较活性
关键改造：将tri4基因异源表达于T. harzianum T34-5.27
产物分析：检测EPT产量与erg1/erg9表达变化
结果①：EPT无植物毒性，trichodermol与HA毒性强
结果②：体内产生EPT下调防御基因，erg1上调3.8-5.2倍，角鲨烯降38-54%
结果③：EPT降低T. harzianum对番茄根定殖（定殖比0.82）
结论：EPT作为早期中间体无直接毒性，但通过复杂信号作用影响植物防御和真菌萜烯代谢
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核心内容

本研究通过在 Trichoderma harzianum T34-5.27 中异源表达 Trichoderma arundinaceum 的 tri4 基因，成功构建了产单端孢霉烯中间产物 EPT 的工程菌株。在 8 天培养中，工程菌 EPT 产量达 36.43 μg/ml，同时 trichodermol 产量为 19.67 μg/ml。研究发现，tri4 表达使 erg1 基因上调 3.8~5.2 倍，角鲨烯积累降低 38%~54%，但麦角甾醇水平无显著变化。纯化 EPT 在 0.1~4 μg/ml 浓度下对番茄无植物毒性，且高达 5 mg/ml 时也无抗 Botrytis cinerea 活性；相比之下，trichodermol 在 1 μg/ml 即表现强烈植物毒性（PR1b1 上调 147.6 倍），哈茨木霉素在 1 μg/ml 以上也有毒性（PR1b1 上调 205 倍）。体内表达 EPT 反而下调番茄 PR1b1（0.284 倍）和 ACCS（0.258 倍），并降低木霉对番茄根的定殖。结果表明单端孢霉烯中间体的生物活性随结构复杂化增强，EPT 作为早期中间体无直接毒性，但会通过信号作用影响植物防御和真菌萜烯代谢平衡。

创新点

首次在非产单端孢霉烯的 T. harzianum 中重建 EPT 产生，证明 EPT 无直接抗真菌或植物毒性；发现 tri4 表达显著上调 erg1 并降低角鲨烯积累但不影响麦角甾醇水平；揭示 EPT 在植物-真菌互作中的复杂信号作用。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Trichoderma harzianum T34-5.27 trichothecene 生物合成 tri4 Tri4 (P450 单加氧酶) 催化 来自 Trichoderma arundinaceum，催化 TD 羟基化生成 EPT
Trichoderma harzianum T34-5.27 trichothecene 生物合成 tri5 trichodiene 合酶 催化 催化 FPP 环化生成 trichodiene (TD)
Trichoderma harzianum T34-5.27 麦角甾醇/萜烯生物合成 erg1 squalene epoxidase (SE) 催化 编码角鲨烯环氧酶，受 tri4 过表达显著上调
Trichoderma harzianum T34-5.27 麦角甾醇/萜烯生物合成 erg9 squalene synthase (SQS) 催化 编码角鲨烯合酶，表达不受 tri4 显著影响

关键发现

  1. tri4 转化株 T34-5.27-tri4.1 在8天培养中 EPT 产量达
  2. 43±10.51 μg/ml，TD 为
  3. 67±6.65 μg/ml；erg1 表达分别上调
  4. 789 倍（P=0.028）和
  5. 246 倍（P=0.031）；角鲨烯积累降低
  6. 4%（T34-5.27-tri4.3）至
  7. 28%（T34-5.27-tri4.2），而麦角甾醇水平无显著变化（7.84~8.31 mg/g干重）。纯化 EPT 在
  8. 1~4 μg/ml 浓度下对番茄无显著植物毒性，也无抗 B. cinerea 活性（至5 mg/ml）；trichodermol 在 1 μg/ml 即显示强烈植物毒性，PR1b1 表达上调
  9. 630 倍（P=0.029）；HA 在 1 μg/ml 以上有植物毒性，PR1b1 和 PR-P2 分别上调 205 倍（P=0.021）和 82 倍（P=0.010）。体内表达 EPT 使番茄 PR1b1 下调
  10. 284 倍（P=0.000）、ACCS 下调
  11. 258 倍（P=0.000），并降低 T. harzianum 对番茄根的定殖能力（定殖比0.82）。

研究结论

三萜生物合成中间体的生物活性随结构复杂化而增强；EPT 作为早期中间体无直接毒性，但体内产生会下调植物防御及发育相关基因并影响真菌萜烯代谢平衡（上调 erg1、降低角鲨烯）；这些结果揭示了单端孢霉烯中间体在植物-真菌互作中的复杂调控作用。