LplR, a Repressor Belonging to the TetR Family, Regulates Expression of the L-Pantoyl Lactone Dehydrogenase Gene in Rhodococcus erythropolis
- 作者
- Dayong Si, Nobuyuki Urano, Sakayu Shimizu, Michihiko Kataoka
- 单位
- Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University; Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Life and Environmental Sciences, Osaka Prefecture University; Faculty of Bioenvironmental Science, Kyoto Gakuen University
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2012）
- DOI
- 10.1128/AEM.01583-12
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Rhodococcus erythropolis AKU2103中L-泛解酸内酯脱氢酶基因(lpldh)的表达调控机制，尤其是1,2-丙二醇诱导lpldh表达的分子机理，并构建高效LPLDH重组菌用于D-泛解酸内酯的生产。
研究策略
通过分析lpldh上下游序列发现TetR家族调控基因lplR，利用基因敲除、过表达、电泳迁移率变动分析（EMSA）和5'-RACE等实验验证LplR对lpldh转录的负调控作用，并在此基础上构建ΔlplR菌株过表达LPLDH用于手性转化。
核心内容
该研究针对红串红球菌AKU2103中L-泛解酸内酯脱氢酶基因lpldh的表达调控机制展开，旨在阐明1,2-丙二醇诱导其表达的分子机理。通过分析lpldh上下游序列，研究者鉴定出TetR家族调控基因lplR，并利用基因敲除、过表达、电泳迁移率变动分析及5'-RACE等实验验证了LplR对lpldh转录的负调控作用。结果显示，敲除lplR后，无诱导条件下lpldh表达量比野生型高22.8倍，LPLDH活性达15.8 mU/mg，而野生型未诱导时活性低于0.1 mU/mg；EMSA证实LplR特异结合于启动子区域中的6-bp反向重复序列，且右侧半序列的关键核苷酸对结合至关重要。进一步构建的ΔlplR菌株过表达LPLDH后，无需添加诱导剂即可高效催化L-泛解酸内酯氧化，0.768 M DL-PL可完全转化为D-PL（转化率>99.9%）。该发现首次揭示了lpldh的转录抑制机制，为通过解除负调控实现不依赖诱导剂的高水平酶表达提供了可行策略，对D-泛解酸内酯的工业化生物转化具有重要意义。
创新点
首次发现并验证LplR是lpldh表达的负调控因子；确定了LplR结合的6-bp反向重复序列（IR）及其关键核苷酸；利用lplR敲除菌株实现了不依赖1,2-PD诱导的高水平LPLDH表达，并用于D-PL的立体转化。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus erythropolis AKU2103 | L-泛解酸内酯氧化为酮泛解酸内酯 | lpldh | LPLDH（L-泛解酸内酯脱氢酶） | 催化 | FMN依赖的L-PL脱氢酶，氧化L-PL生成KPL |
| Rhodococcus erythropolis AKU2103 | lpldh表达调控 | lplR | LplR（TetR家族转录抑制因子） | 调控 | 结合启动子/操纵区反向重复序列，负调控lpldh转录 |
| Rhodococcus erythropolis AKU2103 | lpldh操纵子 | orfD, orfE, orfF, lpldh | 假定蛋白（orfD、orfE、orfF）及LPLDH | 调控 | 三个ORF与lpldh共转录，共同组成一个操纵子 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | lplR | His标签LplR融合蛋白 | 调控 | 用于EMSA实验，证明LplR与IR序列结合 |
| Escherichia coli (pETSmKPR/pACGD) | D-泛解酸内酯合成 | KPR, GDH | 酮泛解酸还原酶、葡萄糖脱氢酶 | 催化 | 共表达KPA还原酶和NADPH再生成酶，用于将KPA还原为D-PA |
关键发现
- 敲除lplR后，lpldh表达量在无1,2-PD诱导下比野生型高22.8倍
- ΔlplR菌株LPLDH活性达到16.3 mU/mg（加1,2-PD）和15.8 mU/mg（不加），而野生型未诱导时活性<0.1 mU/mg，1,2-PD诱导野生型为9.6 mU/mg
- 多拷贝lplR质粒(pKLplR)导入后，即使在1,2-PD存在下也无LPLDH活性
- EMSA证明LplR结合于启动子/操纵区中的6-bp反向重复序列，且右侧半序列的核苷酸长度和序列对结合至关重要
- 重组ΔlplR(pKLPLDH)菌株在无诱导条件下LPLDH活性与诱导条件相当
- 用0.384 M L-PL可完全转化为KPL（>99.9%），1.15 M L-PL时可实现85.5%摩尔产率
- 768 M DL-PL可完全转化为D-PL（>99.9%）。
研究结论
LplR是lpldh表达的负调控因子，通过结合启动子/操纵区中的反向重复序列抑制包含lpldh在内的操纵子的转录。敲除lplR可解除阻遏，使LPLDH在不添加1,2-PD的情况下高表达。利用ΔlplR菌株过表达LPLDH，结合E. coli(pETSmKPR/pACGD)可实现DL-PL到D-PL的高效立体转化。