The Pseudomonas aeruginosa Isohexenyl Glutaconyi Coenzyme A Hydratase (AtuE) Is Upregulated in Citronellate-Grown Cells and Belongs to the Crotonase Family
- 作者
- Nirmal Poudel, Jens Pfannstiel, Oliver Simon, Nadine Walter, Anastassios C. Papageorgiou, Dieter Jendrossek
- 单位
- Turku Centre for Biotechnology, University of Turku and Abo Akademi University, Turku, Finland; Mass Spectrometry Core Facility, Universitat Hohenheim, Stuttgart, Germany; Department of Biosensors, Institute of Physiology, Universitat Hohenheim, Stuttgart, Germany; Institute of Microbiology, Universitat Stuttgart, Stuttgart, Germany
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2015）
- DOI
- 10.1128/AEM.01686-15
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析铜绿假单胞菌中异己烯基戊二酰辅酶A水合酶（AtuE）的结构与功能，阐明其在无环萜类分解代谢中的作用。
研究策略
采用无标记定量蛋白质组学（GeLC-MS/MS）分析香茅酸诱导的蛋白表达变化，结合X射线晶体学解析AtuE的晶体结构，并通过底物对接和结构比较分析其底物识别机制。
核心内容
该研究通过无标记定量蛋白质组学（GeLC-MS/MS）和X射线晶体学，解析了铜绿假单胞菌中异己烯基戊二酰辅酶A水合酶AtuE的结构与功能。研究在香茅酸培养条件下共鉴定到1,640个蛋白，其中187个蛋白丰度增加≥3倍，AtuE上调达23倍，同时Atu途径和Liu途径多个蛋白也显著上调。AtuE晶体结构解析至2.13 Å分辨率，三聚体尺寸约76×79×55 Å，纯化产量为5.7 mg/g细胞湿重。结构分析表明，AtuE属于crotonase家族，其活性位点空腔显著宽于其他家族成员，以适应支链异戊二烯底物，Glu139被鉴定为潜在催化残基，Gly116和Gly68的骨架NH形成氧阴离子洞。这是首次报道能结合支链酰基的烯酰-CoA水合酶结构。该工作揭示了AtuE与PA4330可能协同催化异己烯基戊二酰辅酶A的水合反应，加深了对假单胞菌无环萜类分解代谢途径的理解，为萜类化合物的生物技术生产提供了结构基础和酶学依据。
创新点
首次解析了能结合支链酰基的烯酰-CoA水合酶结构；发现AtuE活性位点空腔显著宽于其他crotonase家族成员，以适应支链异戊二烯底物；蛋白质组学鉴定出187个在香茅酸条件下上调的蛋白，并确定了AtuE的关键催化残基。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | PA1535 | 柠檬酰-CoA脱氢酶（PA1535） | 催化 | 上调39.9倍，具有柠檬酰-CoA脱氢酶活性 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 萜醇氧化 | exaA (PA1982) | 吡咯喹啉醌依赖性乙醇脱氢酶（ExaA） | 催化 | 上调60.8倍，具有萜醇脱氢酶活性 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 萜醇氧化 | exaC (PA1984) | NAD+依赖性醛脱氢酶（ExaC） | 催化 | 上调20.4倍，可能参与萜类代谢 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 亮氨酸/异戊酸利用（Liu）途径 | liuE (PA2011) | 3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA裂解酶（LiuE） | 催化 | 上调13.5倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 亮氨酸/异戊酸利用（Liu）途径 | liuD (PA2012) | 甲基巴豆酰-CoA羧化酶α亚基（LiuD） | 催化 | 上调17.2倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 亮氨酸/异戊酸利用（Liu）途径 | liuC (PA2013) | 3-甲基戊烯二酰-CoA水合酶（LiuC） | 催化 | 上调40.5倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 亮氨酸/异戊酸利用（Liu）途径 | liuB (PA2014) | 甲基巴豆酰-CoA羧化酶β亚基（LiuB） | 催化 | 上调46.7倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 亮氨酸/异戊酸利用（Liu）途径 | liuA (PA2015) | 异戊酰-CoA脱氢酶（LiuA） | 催化 | 上调24.2倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | atuB (PA2887) | 推定脱氢酶（AtuB） | 催化 | 上调115.6倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | atuC (PA2888) | 香叶酰-CoA羧化酶β亚基（AtuC） | 催化 | 上调50.3倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | atuD (PA2889) | 柠檬酰-CoA脱氢酶（AtuD） | 催化 | 上调25.2倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | atuE (PA2890) | 异己烯基戊二酰辅酶A水合酶（AtuE） | 催化 | 上调23.1倍，本文核心，解析了晶体结构，在E. coli中异源表达用于结构研究 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | atuF (PA2891) | 香叶酰-CoA羧化酶α亚基（AtuF） | 催化 | 上调38.2倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径 | atuG (PA2892) | 短链脱氢酶（AtuG） | 催化 | 上调43.5倍 |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | 无环萜利用（Atu）途径（推测） | PA4330 | 推定烯酰-CoA水合酶/异构酶（PA4330） | 催化 | 上调21.2倍，可能参与isohexenyl-glutaconyl-CoA水合反应，缺乏保守催化谷氨酸残基 |
关键发现
- 蛋白质组学共鉴定到1,640个蛋白（占预测蛋白质组的29%），其中187个蛋白在香茅酸培养细胞中丰度增加≥3倍
- AtuE上调23倍，PA4330上调21倍，AtuA-G上调23-116倍，LiuA-E上调14-47倍。AtuE晶体结构解析至2.13 Å分辨率，Rcryst/Rfree为19.8%/25.7%，空间群C2，三聚体尺寸约76×79×55 Å。纯化的AtuE产量为5.7 mg/g细胞湿重，表观分子量约28 kDa。结构分析显示Glu139为潜在催化残基，Gly116和Gly68的骨架NH可能形成氧阴离子洞。AtuE与crotonase家族成员序列同一性为15%-56%，二级结构相似性为73%-95%。
研究结论
AtuE属于crotonase家族，其活性位点具有更宽的空腔以适应支链异戊二烯基团，是首次报道的能结合支链酰基的烯酰-CoA水合酶结构。AtuE与PA4330可能共同负责异己烯基戊二酰辅酶A的水合反应。该工作加深了对假单胞菌萜类代谢的理解，为萜类化合物的生物技术生产提供了基础。