Transposon mutagenesis identifies genes critical for growth of Pseudomonas nitroreducens TX1 on octylphenol polyethoxylates
- 作者
- Tuan Ngoc Nguyen, Chen-Wei Yeh, Po-Chun Tsai, Kyoung Lee, Shir-Ly Huang
- 单位
- 国立阳明大学微生物与免疫学研究所; 国立中央大学生命科学系; 昌原国立大学生物健康科学系; 国立中央大学环境工程研究所
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.01907-16
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定Pseudomonas nitroreducens TX1在辛基酚聚氧乙烯醚(OPEO_n)为唯一碳源生长时的关键基因，并阐明其降解机制。
研究策略
构建含30,000个Tn5插入突变体的突变文库，筛选OPEO_n利用缺陷突变体；通过质粒拯救和测序鉴定插入位点；对候选基因进行框内缺失、回补和酶活测定；比较不同碳源下的生长特性。
核心内容
该研究利用转座子诱变技术系统鉴定了Pseudomonas nitroreducens TX1以辛基酚聚氧乙烯醚（OPEO_n）为唯一碳源生长所需的关键基因。作者构建了含30,000个Tn5插入突变体的文库，筛选获得93个无法利用OPEO_n的突变体，对应42个独立基因、3个非编码序列及1个23S rRNA。通过框内缺失、回补及酶活测定证实，乙醛酸循环关键基因aceA（异柠檬酸裂解酶）和aceB（苹果酸合酶）缺失后菌株丧失在OPEO_n上的生长能力，回补可恢复；而以OPEO_n为碳源时，两种酶活性分别达277.6±5和15.1±5 nmol min⁻¹ mg⁻¹，较琥珀酸条件高8.8倍和1.7倍。同时乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶活性分别升高13.2倍和2.1倍。菌株无法利用PEG400、PEG1000、乙醛或乙醛酸，但可在乙醇酸上缓慢生长。研究提出OPEO_n降解通过从乙氧基链末端逐步切除并释放乙醛的非氧化机制完成，乙醛酸循环在其中发挥必需作用，为烷基酚聚氧乙烯醚生物降解机理提供了新证据。
创新点
首次采用转座子诱变系统全面鉴定参与OPEO_n降解的关键基因；证实乙醛酸循环在OPEO_n降解中的必需性；提出通过exo-scission释放乙醛的非氧化降解机制。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | — | — | — | — | 模式菌株，能利用0.05%-20% OPEO_n为唯一碳源 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 乙醛酸循环 | aceA | 异柠檬酸裂解酶 (isocitrate lyase) | 催化 | 缺失导致无法利用OPEO_n，回补恢复 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 乙醛酸循环 | aceB | 苹果酸合酶 (malate synthase) | 催化 | 缺失导致无法利用OPEO_n，回补恢复 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 乙醛酸/乙醇酸代谢 | glcE | 乙醇酸脱氢酶 (glycolate dehydrogenase) | 催化 | 缺失不影响OPEO_n利用，但影响乙醇酸利用 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 脂肪酸氧化/能量代谢 | fixC | 脱氢酶 (dehydrogenase, flavoprotein) | 催化 | 转座子插入有极性效应，框内缺失不影响OPEO_n生长 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 信号传导/压力响应 | hit | 二腺苷四磷酸水解酶 (diadenosine tetraphosphate hydrolase) | 催化 | 参与调控Ap4A浓度，可能涉及压力响应 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 细胞膜稳态 | dedA | DedA膜蛋白 | 区室化 | 涉及膜稳态和质子动势 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 细胞壁/膜生物合成 | rfaG | 糖基转移酶 (glycosyltransferase) | 催化 | 涉及脂多糖合成 |
| Pseudomonas nitroreducens TX1 | 细胞壁/膜生物合成 | rfe | UDP-N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶 | 催化 | 参与细胞壁聚合物合成 |
关键发现
- 构建了30,000个Tn5插入突变体，筛出93个(0.31%)不能利用OPEO_n的突变体，鉴定出42个独立基因、3个非编码序列和1个23S rRNA。aceA（异柠檬酸裂解酶）和aceB（苹果酸合酶）缺失突变体无法在OPEO_n上生长，回补后恢复
- glcE缺失不影响生长。OPEO_n生长时异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶活性分别为277.6±5和15.1±5 nmol min^-1 mg^-1，较琥珀酸生长时高8.8倍和1.7倍
- 乙醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶活性较琥珀酸生长时分别高13.2倍和2.1倍。TX1不能利用PEG400、PEG1000、乙醛或乙醛酸，在乙醇酸上生长缓慢（世代时间10.8-11.8 h）。TX1ΔglcE和TX1ΔaceB不能利用乙醇酸，而TX1ΔaceA可以。
研究结论
乙醛酸循环是P. nitroreducens TX1利用OPEO_n的关键代谢途径；OPEO_n降解通过从乙氧基链末端逐步切除并释放乙醛的非氧化机制完成，为APEO_n生物降解提供了新的证据。