高级醇 · 代谢工程文献库

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Directed Evolution of Methanococcus jannaschii Citramalate Synthase for Biosynthesis of 1-Propanol and 1-Butanol by Escherichia coli

作者
Shota Atsumi, James C. Liao
单位
Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles
杂志
Applied and Environmental Microbiology（2009）
DOI
10.1128/AEM.02046-08
所属领域
代谢工程
关键词
1-butanol1-propanol2-keto acid pathwaybiofuelscitramalate synthasedirected evolution
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解决的核心问题

如何通过定向进化提高异源来源的柠檬酸合酶（CimA）在大肠杆菌中的活性、解除异亮氨酸反馈抑制，从而增强2-酮丁酸供应，实现1-丙醇和1-丁醇的高效生产。

研究策略

利用2-酮酸途径与氨基酸生物合成的关联，构建异亮氨酸营养缺陷型菌株，以生长表型为筛选压力，通过易错PCR和DNA改组对来自超嗜热古菌Methanococcus jannaschii的CimA进行多轮定向进化，获得活性提高且对异亮氨酸不敏感的突变体，并应用于1-丙醇和1-丁醇发酵。

研究路线图

100%
定向进化CimA，解除反馈抑制，提高醇产量
构建Ile营养缺陷型菌株，以生长表型为筛选压力
易错PCR + DNA改组 多轮进化CimA（获得CimA3.7）
CimA3.7酶活提高6.7倍，解除Ile抑制，热稳定性增强
1-丙醇2778 mg/L（9.2倍）；1-丁醇393 mg/L（21.9倍）
92h发酵：1-丙醇超3.5 g/L，1-丁醇524 mg/L
基于2-酮酸途径的进化策略，可推广至其他高级醇生物合成
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核心内容

本研究针对超嗜热古菌Methanococcus jannaschii的柠檬酸合酶（CimA）在大肠杆菌中活性低且受异亮氨酸反馈抑制的问题，采用基于生长的定向进化策略进行改造。作者利用2-酮丁酸途径与异亮氨酸生物合成的关联，构建异亮氨酸营养缺陷型菌株，以生长表型为筛选压力，通过易错PCR和DNA改组对cimA进行多轮进化，获得突变体CimA3.7。该变体在30°C下kcat为0.84 s⁻¹，催化效率较野生型提高6.7倍，且在30–70°C范围内活性均高于野生型；40 mM异亮氨酸存在下野生型活性下降64%，而CimA3.7完全不受抑制。将CimA3.7与2-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶共表达于大肠杆菌，1-丙醇产量达2778 mg/L，较野生型提高9.2倍，1-丁醇达393 mg/L，提高21.9倍；92小时发酵后两种醇产量分别超过3.5 g/L和524 mg/L。该工作首次将柠苹酸途径用于高级醇生产，并将非生长相关产物的酶进化与生长表型耦合，为其他产物的定向进化提供了通用筛选策略。

创新点

首次利用柠苹酸途径生产1-丙醇和1-丁醇；将2-酮酸途径与基于生长的定向进化策略相结合，成功筛选出非生长相关产物的高产菌株；获得的CimA变体（CimA3.7）在宽温度范围内活性提高，并丧失了异亮氨酸反馈抑制敏感性。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli 柠苹酸途径 cimA及其突变体cimA1, cimA2, cimA3.7等 柠檬酸合酶（CimA） 催化 来自Methanococcus jannaschii，催化丙酮酸与乙酰辅酶A缩合生成(R)-柠苹酸；经定向进化后活性提高且解除异亮氨酸反馈抑制
Escherichia coli 柠苹酸途径 leuABCD LeuA/LeuC/LeuD/LeuB 催化 将柠苹酸经LeuCD和LeuB反应转化为2-酮丁酸
Escherichia coli 2-酮酸发酵途径 kivd 2-酮酸脱羧酶（Kivd） 催化 催化2-酮丁酸、2-酮戊酸等脱羧生成相应的醛
Escherichia coli 2-酮酸发酵途径 ADH2 醇脱氢酶（ADH2） 催化 将醛还原为1-丙醇和1-丁醇
Escherichia coli 异亮氨酸生物合成及2-酮丁酸竞争途径 ilvA, tdcB, ilvI, ilvB 无（基因敲除） 调控 敲除ilvA和tdcB阻断苏氨酸生成2-酮丁酸的旁路并导致异亮氨酸营养缺陷；敲除ilvI和ilvB减少2-酮丁酸向异亮氨酸的分流及竞争性2-酮酸底物，增强目标产物合成

关键发现

  1. 进化得到的CimA3.7在30°C下kcat为0.84 s^-1，K_m(乙酰辅酶A)为105 μM，kcat/K_m较野生型提高6.7倍
  2. CimA3.7在30-70°C范围内比活性均高于野生型，在30°C时野生型比活性70°C下降2.2倍，CimA3.7仅下降1.3倍
  3. 野生型CimA在40 mM和80 mM异亮氨酸存在下活性分别下降64%和80%，而CimA3.7完全不受影响。在KS145菌株中，表达野生型CimA时1-丙醇产量为302 mg/L、1-丁醇为18 mg/L
  4. 表达CimA3.7的菌株产量分别达到2778 mg/L（9.2倍）和393 mg/L（21.9倍）
  5. 在92小时发酵中，CimA3.7菌株最终产生超过3.5 g/L 1-丙醇和524 mg/L 1-丁醇。

研究结论

通过基于2-酮酸途径的生长选择策略，成功进化出适应中温宿主的高活性柠檬酸合酶变体，显著提高了1-丙醇和1-丁醇的产量。该策略将非生长相关产物的定向进化与生长表型联系起来，为其他高级醇生物合成提供了通用方法。