高级醇 · 代谢工程文献库

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Engineering of 2,3-Butanediol Dehydrogenase To Reduce Acetoin Formation by Glycerol-Overproducing, Low-Alcohol Saccharomyces cerevisiae

作者
Maryam Ehsani, Maria R. Fernández, Josep A. Biosca, Anne Julien, Sylvie Dequin
单位
INRA, UMR1083, F-34060 Montpellier, France; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Sciences, Universitat Autònoma de Barcelona, E-08193 Bellaterra (Barcelona), Spain; Lallemand SAS, 19 Rue Briquetiers, F-31700 Blagnac, France
杂志
Applied and Environmental Microbiology（2009）
DOI
10.1128/AEM.02157-08
所属领域
代谢工程
关键词
2,3-butanediol dehydrogenaseNADH/NADPH cofactor engineeringSaccharomyces cerevisiaeacetoinglycerol overproductionlow-alcohol wine
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解决的核心问题

甘油过量生产的酿酒酵母菌株在降低乙醇产量的同时积累大量acetoin，影响葡萄酒感官品质，需要将acetoin转化为感官中性的2,3-丁二醇。

研究策略

在过量表达GPD1且缺失ALD6的酿酒酵母中，分别过表达编码天然NADH依赖型Bdh1的BDH1和编码经工程改造的NADPH依赖型Bdh1（Bdh1 221,222,223）的突变基因，促进acetoin还原为2,3-丁二醇，同时考察NADH可用性对反应的限制。

研究路线图

100%
研究问题：甘油过量生产低醇酵母积累大量乙偶姻（acetoin），影响葡萄酒感官品质
策略：在V5 ald6Δ GPD1过表达菌株中，分别过表达天然NADH依赖型Bdh1和工程NADPH依赖型Bdh1（221,222,223）
关键改造①：GPD1过表达（pVT100U-ZEO-GPD1）引导碳流向甘油；敲除ALD6减少乙酸
关键改造②：过表达BDH1（NADH依赖型）催化acetoin→2,3-BD
关键改造③：过表达BDH1 221,222,223（NADPH依赖型突变体）
结果①：Bdh1过表达使83%~90%的acetoin转化为2,3-BD（从5.9~7.6降至0.8~1.2 g/L）
结果②：双乙酰产量减半（32.7→14.3~16.0 μg/L）；甘油产量降低或接近；乙醇减少20%（降醇2.1~2.8度）
结果③：高级醇和酯类影响很小，异戊醇进一步降低；敲除BDH1证实其为2,3-BD合成酶
结论：Bdh1合成水平与NADH可用性共同限制acetoin还原；过表达Bdh1（NADH或NADPH依赖型）可将大部分acetoin转化为感官中性的2,3-BD并降低双乙酰，为开发低乙醇、理想风味的葡萄酒酵母提供新途径
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核心内容

该研究针对甘油过量生产、低乙醇产量的酿酒酵母在酒精发酵中大量积累乙偶姻（acetoin）、影响葡萄酒感官品质的问题，在过量表达GPD1且缺失ALD6的V5菌株中分别过表达天然NADH依赖型Bdh1及工程改造的NADPH依赖型Bdh1突变体，以促进乙偶姻还原为感官中性的2,3-丁二醇，并考察辅因子供应对反应的限制。结果显示，在含50 g/L葡萄糖的培养基中，过表达NADH依赖型Bdh1使乙偶姻从1,492 mg/L降至935 mg/L（减少37%），而过表达NADPH依赖型突变体则降至361 mg/L（减少61%），表明辅因子特异性改造可显著提升转化效率。在模拟葡萄汁发酵中，两种过表达策略均使83%~90%的乙偶姻转化为2,3-丁二醇，最终乙偶姻浓度从5.9~7.6 g/L降至0.8~1.2 g/L，同时双乙酰产量减半（从32.7 μg/L降至约15 μg/L），乙醇含量比野生型降低最多2.8度，而对高级醇和酯类影响很小。该策略有效解决了低乙醇葡萄酒酵母的副产物积累问题，为开发感官品质优良的低醇葡萄酒酵母提供了可行途径。

创新点

['首次在甘油过量生产、低乙醇葡萄酒酵母中系统评估Bdh1表达量和辅因子NADH/NADPH对acetoin还原为2,3-BD反应的限制作用', '利用辅因子特异性改造的Bdh1（NADPH依赖型）实现了比天然NADH依赖型Bdh1更高效的acetoin转化', '证明通过Bdh1过表达可将85%~90%积累的acetoin转化为2,3-BD，同时使双乙酰产量减半']

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae V5（香槟葡萄酒酵母衍生菌株） 甘油合成途径 GPD1 甘油-3-磷酸脱氢酶（Gpd1） 催化 多拷贝质粒pVT100U-ZEO-GPD1过表达，将碳流转向甘油
Saccharomyces cerevisiae V5 乙醛代谢/乙酸合成途径 ALD6 乙醛脱氢酶（Ald6） 催化 敲除ALD6以减少乙酸生成
Saccharomyces cerevisiae V5 2,3-丁二醇合成途径 BDH1 2,3-丁二醇脱氢酶（Bdh1） 催化 过表达天然NADH依赖型Bdh1，将acetoin还原为2,3-BD
Saccharomyces cerevisiae V5 2,3-丁二醇合成途径 BDH1 221,222,223 突变体Bdh1（221 EIA 223 → 221 SRS 223） 催化 工程改造的NADPH依赖型Bdh1，辅因子偏好从NADH转变为NADPH
Saccharomyces cerevisiae V5 乙偶姻/双乙酰还原途径 BDH1 Bdh1 催化 Bdh1还催化双乙酰还原为acetoin，过表达使双乙酰产量减半

关键发现

  1. ['敲除BDH1后，V5 bdh1菌株不再产生(2R,3R)-2,3-BD，总2,3-BD产量仅为野生型的约15%（84 vs 553 mg/liter），并积累约401 mg/liter acetoin，双乙酰产量提高约2倍（15.8 vs 7.9 μg/liter）', '在含50 g/liter葡萄糖的MS培养基中，V5 ald6 GPD1菌株积累1,492 mg/liter acetoin
  2. 过表达BDH1后acetoin降至935 mg/liter（减少37%），过表达BDH1 221,222,223后降至361 mg/liter（减少61%）', '在含200和240 g/liter葡萄糖的模拟葡萄汁发酵中，过表达BDH1或BDH1 221,222,223可使83%~90%的acetoin转化为2,3-BD，最终acetoin浓度从5.9~7.6 g/liter降至0.8~1.2 g/liter', '过表达NADH依赖型Bdh1使甘油产量比V5 ald6 GPD1降低约3 g/liter（27→24 g/liter，200 g/liter葡萄糖）
  3. 过表达NADPH依赖型Bdh1则恢复甘油水平至26 g/liter', '双乙酰产量在V5 ald6 GPD1中为32.7 μg/liter，过表达BDH1和BDH1 221,222,223后分别降至14.3和16.0 μg/liter，均远低于葡萄酒中双乙酰的感知阈值', '最终乙醇产量比野生型减少约20%，在200和240 g/liter葡萄糖下酒精含量分别降低2.1和2.8度（例如240 g/liter葡萄糖下从15.0°降至12.2~12.4°）', '过表达Bdh1对高级醇和酯类产量影响很小，主要影响是异戊醇进一步降低（V5 ald6 GPD1 BDH1中60.1 mg/liter vs V5 ald6 GPD1中88.4 mg/liter）']

研究结论

在甘油过量生产且ALD6缺失的酿酒酵母中，Bdh1的合成水平和NADH可用性共同限制acetoin还原为2,3-BD，其中发酵过程中Bdh1合成水平是主要限制因素。过表达天然NADH依赖型或工程NADPH依赖型Bdh1均能将大部分acetoin转化为感官中性的2,3-BD，同时使双乙酰产量减半，且对主要香气物质影响很小。该策略可将葡萄酒乙醇含量降低最多3度，为开发低乙醇且具有理想感官特征的葡萄酒酵母提供了新途径。