Novel Redox Potential-Based Screening Strategy for Rapid Isolation of Klebsiella pneumoniae Mutants with Enhanced 1,3-Propanediol-Producing Capability
- 作者
- Chenyu Du, Yanping Zhang, Yin Li, Zhu'an Cao
- 单位
- Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, People's Republic of China; Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, People's Republic of China
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2007）
- DOI
- 10.1128/AEM.02857-06
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
1,3-丙二醇缺乏特异性紫外吸收峰且与底物甘油及副产物（乙醇、乳酸、乙酸等）化学结构相似，难以基于产物直接检测建立高通量筛选方法；同时，对1,3-丙二醇的耐受性与产量无直接关联。因此需要开发一种快速有效的基于生物合成机制的筛选策略，以获得1,3-丙二醇高产突变株。
研究策略
利用氧化还原电位（ORP）作为环境选择压力：首先确定野生型菌株生长和产1,3-丙二醇的有利ORP范围（-160至-190 mV），然后对化学诱变（UV+LiCl）后的突变库在不利于野生型的还原电位（-240 mV或-280 mV）下培养，筛选在此条件下仍具有高比生长速率的菌落，通过摇瓶发酵验证其1,3-丙二醇产量，并对最佳突变株进行补料分批发酵和代谢分析。
核心内容
针对1,3-丙二醇缺乏特异性紫外吸收且与副产物结构相似导致难以建立直接高通量筛选方法的问题，本研究开发了一种基于氧化还原电位（ORP）的新型筛选策略。首先确定野生型肺炎克雷伯氏菌生长和产1,3-丙二醇的最适ORP范围为-160至-190 mV，随后将经UV和LiCl化学诱变的突变库在不利于野生型的还原电位（-240 mV或-280 mV）下培养，筛选仍保持高比生长速率的菌落。结果显示，在-280 mV条件下11株分离菌中有4株被认定为阳性突变株，阳性率显著高于基于细胞生长相关性的传统方法（2/67）。最佳突变株YMU1在恒定-280 mV条件下1,3-丙二醇产量达915 mmol/L，较亲本提高63.1%，细胞干重和比生产力分别提高68.0%和20.7%。代谢通量分析揭示突变株通过降低最适ORP、强化还原分支、减少乙酸积累（降至亲本30%）以及降低胞内NAD+/NADH比值（由约4降至2）来实现产量提升。该工作首次将ORP作为环境选择压力用于高产菌株筛选，为与氧化还原反应耦合的生物转化系统菌株改良提供了高效通用途径。
创新点
首次将ORP作为环境选择压力用于随机诱变后高产菌株的筛选；与仅基于细胞生长相关性的筛选方法（阳性率2/67）相比，ORP筛选方法在-280 mV下阳性率达4/11，显著提高筛选效率；揭示了突变株通过降低最适ORP、强化细胞内还原分支来提高1,3-丙二醇产量的机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae M5aL | 甘油代谢途径（1,3-丙二醇合成） | — | 甘油脱水酶（glycerol dehydratase） | 催化 | 催化甘油转化为3-羟基丙醛，是1,3-丙二醇合成途径的限速步骤 |
| Klebsiella pneumoniae M5aL | 甘油代谢途径（1,3-丙二醇合成） | — | 1,3-丙二醇脱氢酶（1,3-propanediol dehydrogenase） | 催化 | 催化3-羟基丙醛还原为1,3-丙二醇，同时再生NAD+ |
关键发现
- 在-280 mV ORP筛选实验中，11株分离菌中有4株被认定为阳性突变株
- 突变株YMU1的最适ORP为-280 mV，显著低于亲本的-190 mV
- 在恒定-280 mV条件下，YMU1的1,3-丙二醇浓度达915 mmol/L，比亲本提高63.1%，细胞干重4.52 g/L，提高68.0%，比生产力4.23 mmol g(CDW)^-1 h^-1，提高20.7%
- 代谢通量分析显示突变株还原分支增强，2,3-丁二醇产量由<0.1 mmol g(CDW)^-1 h^-1增至0.45 mmol g(CDW)^-1 h^-1，乙酸产量降至亲本的30%
- 胞内NAD+/NADH比值由约4降至2。此外，细胞生长相关性筛选方法从67株中仅获得2株阳性，而ORP筛选效率更高。
研究结论
基于ORP的筛选策略能够高效分离1,3-丙二醇高产突变株，突变株通过降低最适ORP、强化还原分支、减少乙酸积累和改变胞内氧化还原状态（NAD+/NADH比值降低）来提高1,3-丙二醇产量，该方法为微生物菌株改良提供了新途径，可推广至其他与氧化还原反应耦合的生物转化系统。