LacI Transcriptional Regulatory Networks in Clostridium thermocellum DSM1313
- 作者
- Charlotte M. Wilson, Dawn M. Klingeman, Caleb Schlachter, Mustafa H. Syed, Chia-wei Wu, Adam M. Guss, Steven D. Brown
- 单位
- BioEnergy Science Center, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee 37831, USA; Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee 37831, USA
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1128/AEM.02751-16
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解析Clostridium thermocellum DSM1313中三个LacI家族转录调控因子（GlyR1、GlyR2、GlyR3）的调控网络，揭示其对木质纤维素降解酶基因的调控机制。
研究策略
利用可遗传操作的DSM1313菌株构建三个lacI基因（Clo1313_2023、Clo1313_0089、Clo1313_0396）的敲除突变体，在pH受控的发酵条件下比较其在纤维二糖或预处理柳枝稷上的生长，通过时间序列RNA-seq分析全局基因表达差异，结合EMSA和糖干扰实验验证转录因子与靶启动子的直接结合及诱导物。
核心内容
本研究以热纤梭菌DSM1313为对象，系统解析了三个LacI家族转录调控因子GlyR1、GlyR2和GlyR3对木质纤维素降解酶基因的调控网络。作者利用可遗传操作的菌株分别敲除三个lacI基因，在pH受控发酵条件下比较突变体在纤维二糖或预处理柳枝稷上的生长，并通过时间序列RNA-seq、EMSA及糖干扰实验鉴定靶基因与诱导物。结果显示三个调控因子均属局部调控因子：ΔglyR1中地衣多糖酶基因licB显著去抑制，稳定期log2倍数变化达6.64（约100倍）；ΔglyR2中甘露聚糖酶基因man5A上调约25~50倍，且α-甘露二糖可破坏GlyR2与DNA的结合；ΔglyR3中celC和licA分别上调约3.8 log2倍。EMSA证实GlyR1、GlyR2和GlyR3分别结合licB、man5A和celC上游区域。该工作首次绘制了这三个调控子的全局调控图谱，揭示了它们主要作为半纤维素酶基因的抑制因子发挥作用，为理解热纤梭菌的碳代谢调控机制及菌株工程改造提供了重要理论基础。
创新点
首次系统鉴定了C. thermocellum DSM1313中三个LacI调控子的全局调控图谱；发现GlyR1调控LicB（地衣多糖酶），GlyR2调控Man5A（甘露聚糖酶）且α-甘露二糖为其可能的诱导物；确认GlyR3调控celC-glyR3-licA操纵子；通过基因组重测序排除了突变背景对转录组结果的干扰。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum DSM1313 | 木质纤维素降解 | Clo1313_2023 | GlyR1 | 调控 | LacI家族转录调控因子，敲除后licB（Clo1313_2022）去抑制 |
| Clostridium thermocellum DSM1313 | 半纤维素降解 | Clo1313_2022 | LicB | 催化 | 地衣多糖酶（β-1,3-1,4-葡聚糖酶），含Dockerin I结构域，受GlyR1直接抑制 |
| Clostridium thermocellum DSM1313 | 半纤维素降解 | Clo1313_0089 | GlyR2 | 调控 | LacI家族转录调控因子，敲除后man5A（Clo1313_1398）显著上调 |
| Clostridium thermocellum DSM1313 | 甘露聚糖降解 | Clo1313_1398 | Man5A | 催化 | 甘露聚糖酶（GH5/CBM32），含Dockerin I，受GlyR2直接抑制，α-甘露二糖为诱导物 |
| Clostridium thermocellum DSM1313 | β-葡聚糖降解 | Clo1313_0396 | GlyR3 | 调控 | LacI家族转录调控因子，调控celC-glyR3-licA操纵子，层二糖为效应物 |
| Clostridium thermocellum DSM1313 | β-葡聚糖降解 | Clo1313_0395 | CelC | 催化 | 糖苷水解酶家族5成员，与GlyR3位于同一操纵子，受GlyR3抑制 |
| Clostridium thermocellum DSM1313 | β-葡聚糖降解 | Clo1313_0397 | LicA | 催化 | 葡聚糖内切-1,3-β-D-葡萄糖苷酶，非细胞体酶，受GlyR3抑制 |
| Escherichia coli | 异源蛋白表达 | lacI基因（Clo1313_2023, Clo1313_0089, Clo1313_0396） | GlyR1/GlyR2/GlyR3 | 调控 | 用于EMSA实验的蛋白表达纯化 |
关键发现
- 敲除glyR1、glyR2或glyR3后，在纤维二糖或预处理柳枝稷上生长无显著差异。RNA-seq显示三个LacI均为局部调控因子，各自调控少数基因。ΔglyR1菌株中Clo1313_2022（licB）显著去抑制，log2倍数变化在早对数期、晚对数期和稳定期分别为4.33、4.44和6.64（即约20~100倍）
- ΔglyR2菌株中Clo1313_1398（man5A）表达上调，log2倍数分别为4.65、4.58和5.66（约25~50倍），且α-甘露二糖可破坏GlyR2与DNA结合
- ΔglyR3菌株中celC（Clo1313_0395）和licA（Clo1313_0397）分别上调约3.82~3.89和3.75~3.82 log2倍。差异基因数量：ΔglyR1在三个时相分别为13、23和1092个
- ΔglyR2为41、26和46个
- ΔglyR3为31、65和75个。EMSA证实GlyR1结合licB上游232 bp区域，GlyR2结合man5A上游149 bp区域，GlyR3结合celC上游区域。
研究结论
C. thermocellum DSM1313中的三个LacI转录因子（GlyR1、GlyR2、GlyR3）均为局部调控因子，主要抑制半纤维素酶基因的表达。GlyR1直接抑制licB，GlyR2直接抑制man5A且α-甘露二糖为诱导物，GlyR3抑制celC-glyR3-licA操纵子。这些调控子的鉴定加深了对该菌木质纤维素降解调控机制的理解，为菌株改良提供了理论基础。