High-Level Production of Beta-Carotene in Saccharomyces cerevisiae by Successive Transformation with Carotenogenic Genes from Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- René Verwaal, Jing Wang, Jean-Paul Meijnen, Hans Visser, Gerhard Sandmann, Johan A. van den Berg, Albert J. J. van Ooyen
- 单位
- Fungal Genomics, Laboratory of Microbiology, Wageningen University, Dreijenlaan 2, 6703 HA Wageningen, The Netherlands; Biosynthesis Group, Molecular Biosciences 213, J. W. Goethe Universität, Siesmayerstrasse 70, P.O. Box 111932, D-60054 Frankfurt, Germany
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2007）
- DOI
- 10.1128/AEM.02759-06
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在酿酒酵母中实现β-胡萝卜素的高效异源生产，解决游离表达载体不稳定、类胡萝卜素合成通量不足及八氢番茄红素脱饱和瓶颈等问题。
研究策略
将红法夫酵母的类胡萝卜素合成基因（crtYB、crtI、crtE）及酿酒酵母自身的BTS1和截短HMG1（tHMG1）通过整合型载体逐步整合到基因组中，实现稳定过表达，并通过额外拷贝crtI和tHMG1解除瓶颈、增强前体供给。
核心内容
本研究通过整合型载体将红法夫酵母的类胡萝卜素合成基因（crtYB、crtI、crtE）以及酿酒酵母自身的BTS1和截短HMG1（tHMG1）逐步整合至酿酒酵母基因组中，实现了稳定过表达。研究发现，游离型表达crtYB和crtI时总类胡萝卜素仅为3 μg/g干重，额外表达BTS1提升至83 μg/g（28倍），额外表达crtE则达487 μg/g（162倍）。整合型菌株YB/I/E获得总类胡萝卜素1,545 μg/g，进一步过表达tHMG1使总量增至11,222 μg/g，但其中八氢番茄红素占10,302 μg/g，β-胡萝卜素仅501 μg/g，表明脱饱和步骤成为瓶颈。通过额外整合一个crtI拷贝，β-胡萝卜素升至1,627 μg/g（占68%）。最终组合菌株YB/I/E+tHMG1+额外crtI实现β-胡萝卜素产量5,918 μg/g干重（5.9 mg/g），较此前报道高57倍，总类胡萝卜素达11,298 μg/g。同时，整合型菌株传代后失去颜色的细胞比例低于0.5%，而游离型约为10%，证明整合策略显著提升了遗传稳定性。该研究为利用酿酒酵母工业化生产β-胡萝卜素提供了高产的稳定平台。
创新点
采用整合型载体替代游离型载体显著提高遗传稳定性；通过额外整合crtI和过表达tHMG1的组合策略，大幅提升β-胡萝卜素产量至5.9 mg/g（干重），较此前报道高57倍。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | CrtYB (dual-function phytoene synthase and lycopene cyclase) | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化两分子GGPP合成八氢番茄红素及番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | CrtI (phytoene desaturase) | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化八氢番茄红素经四次脱氢生成番茄红素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成途径 / 甲羟戊酸途径 | crtE | CrtE (geranylgeranyl diphosphate synthase) | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，催化FPP转化为GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 / 类胡萝卜素前体供给 | BTS1 | Bts1 (geranylgeranyl diphosphate synthase) | 催化 | 酿酒酵母内源GGPP合酶，可催化FPP转化为GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | Truncated HMG-CoA reductase (catalytic domain) | 催化 | 编码截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶催化域，过表达增加类胡萝卜素前体供给 |
关键发现
- 游离型表达crtYB和crtI时总类胡萝卜素仅3 μg/g dw
- 额外表达BTS1增至83 μg/g dw（28倍）
- 额外表达crtE增至487 μg/g dw（162倍）。整合型菌株YB/I/E总类胡萝卜素1,545 μg/g dw，YB/I/BTS1为508 μg/g dw。过表达tHMG1使总类胡萝卜素达11,222 μg/g dw（726%），但其中phytoene高达10,302 μg/g dw，β-胡萝卜素仅501 μg/g dw。额外整合crtI后β-胡萝卜素升至1,627 μg/g dw（占68%）。最终组合菌株YB/I/E+tHMG1+额外crtI产生β-胡萝卜素5,918 μg/g dw（5.9 mg/g dw），总类胡萝卜素11,298 μg/g dw。游离型转化体约10%细胞在传代后失去颜色，整合型则低于0.5%，表明整合型显著提高稳定性。
研究结论
通过整合并过表达红法夫酵母的类胡萝卜素合成基因，结合额外拷贝crtI和过表达截短的HMG-CoA还原酶，成功构建了高产β-胡萝卜素的酿酒酵母菌株，产量达5.9 mg/g（干重），较此前报道高57倍，为生物技术生产β-胡萝卜素提供了有前景的平台。