Enhancing terpene yield from sugars via novel routes to 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate
- 作者
- James Kirby, Minobu Nishimoto, Ruthie W.N. Chow, Edward E. K. Baidoo, George Wang, Joel Martin, Wendy Schackwitz, Rossana Chan, Jeffrey L. Fortman, Jay D. Keasling
- 单位
- California Institute of Quantitative Biosciences (QB3), University of California, Berkeley, California, USA; Joint BioEnergy Institute, Emeryville, California, USA; Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, California, USA; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, California, USA; Joint Genome Institute, Walnut Creek, California, USA
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2015）
- DOI
- 10.1128/AEM.02920-14
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
DXP途径第一步由Dxs酶催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合，损失1/6的碳，且Dxs受多种调控机制限制。需要寻找从戊糖磷酸直接生成DXP的新途径，以提高萜烯产量并规避调控。
研究策略
采用定向进化策略，在dxs缺失的大肠杆菌菌株中以木糖为唯一碳源进行选择，筛选能恢复生长的突变体或过表达基因，并利用体外酶活验证和代谢物分析确认新途径。
核心内容
针对DXP途径中Dxs酶催化第一步反应导致碳损失并受调控限制的问题，本研究在大肠杆菌中利用定向进化策略，以木糖为唯一碳源筛选dxs缺失菌株的生长恢复株，发现了两种绕过Dxs的新型nDXP途径。其一是过表达yajO基因，其二是ribB基因突变（如G108S、S89R等），体外酶活实验证实YajO和RibB突变体可直接催化核酮糖-5-磷酸转化为DXP。表达yajO或ribB(G108S)使α-bisabolene产量提高2至3倍，构建Dxr-RibB(G108S)融合蛋白后产量进一步提升4.3倍；在amorphadiene生产中，ribB(G92D)突变株在添加5 mM甲羟戊酸时产量达5.4 mg/L（17 mg/g DCW），为对照的4倍以上。代谢物分析显示融合菌株中DXP不积累而MEcPP积累3倍，表明底物通道效应增强碳流向效率。从葡萄糖经nDXP途径合成bisabolene的理论产率为0.309 g/g，接近理论最大值0.324 g/g。该途径规避了Dxs的调控瓶颈并提高了碳原子保留率，为微生物萜烯高效合成提供了新的替代策略。
创新点
['首次发现YajO和RibB突变体能够催化Ru5P直接转化为DXP，建立绕过Dxs的nDXP途径', '构建Dxr-RibB融合蛋白，提高底物通道效率，bisabolene产量提高4.3倍', 'nDXP途径碳原子保留率高，理论产量接近最大生物化学产率']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli (MG1655, BL21(DE3)) | DXP途径（非甲羟戊酸途径） | yajO | YajO | 催化 | 将Ru5P直接转化为DXP，形成nDXP途径 |
| Escherichia coli | DXP途径 | ribB | RibB（突变体G108S等） | 催化 | 突变型RibB将Ru5P转化为DXP，补充dxs缺失 |
| Escherichia coli | DXP途径 | dxs | Dxs（DXP合酶） | 催化 | 原途径第一步，被敲除或过表达 |
| Escherichia coli | DXP途径 | ispC (dxr) | Dxr（DXP还原异构酶） | 催化 | 与RibB(G108S)构建融合蛋白增强通量 |
| Escherichia coli | DXP途径 | ispD, ispF, idi, ispA | IspD, IspF, Idi, IspA | 催化 | DXP途径下游基因，过表达以增强bisabolene合成 |
| Escherichia coli | 萜烯合成 | AgBIS（来自Abies grandis） | α-bisabolene合酶 | 催化 | 催化FPP生成bisabolene |
关键发现
['通过筛选dxs缺失菌株在木糖上的生长恢复，分离出两个nDXP途径：yajO过表达和ribB基因突变（S89R、G92D、T106I等）', '体外实验证实YajO和RibB(G108S)能催化Ru5P生成DXP', '表达yajO或ribB(G108S)使bisabolene产量提高2-3倍', 'Dxr-RibB(G108S)融合蛋白使bisabolene产量提高4.3倍', '在amorphadiene生产中，ribB(G92D)突变株无甲羟戊酸时产生2 mg/L amorphadiene，添加5 mM甲羟戊酸后产量为5.4 mg/L（17 mg/g DCW），是对照的4倍以上', '代谢物分析显示Dxr-RibB融合菌株中DXP不积累，MEcPP积累3倍（13.9增至38.7）', '从葡萄糖经nDXP途径合成bisabolene的理论产率为0.309 g/g，接近最大理论产率0.324 g/g']
研究结论
本研究发现的新型nDXP途径（YajO和RibB突变体）可直接将Ru5P转化为DXP，不仅提高了碳利用效率，还规避了Dxs的调控，为微生物萜烯合成提供了高效替代途径。