Substrate Promiscuity: AglB, the Archaeal Oligosaccharyltransferase, Can Process a Variety of Lipid-Linked Glycans
- 作者
- Chen Cohen-Rosenzweig, Ziqiang Guan, Boaz Shaanan, Jerry Eichler
- 单位
- Department of Life Sciences, Ben Gurion University of the Negev, Beersheva, Israel; Department of Biochemistry, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2014）
- DOI
- 10.1128/AEM.03191-13
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
古菌寡糖转移酶AglB如何应对不同脂质连接聚糖底物的多样性，即其是否具有底物混杂性及底物特异性程度如何。
研究策略
比较来自四种盐古菌（Hfx. volcanii、Har. marismortui、Hbt. salinarum、Hfx. mediterranei）AglB的序列和预测结构；在Hfx. volcanii aglB缺失菌株中异源表达不同来源的AglB，利用LC-ESI MS/MS检测S层糖蛋白Asn-13的N-糖基化恢复情况，并通过[2-3H]甘露糖标记评估各AglB的功能效率。
核心内容
该研究以四种盐古菌的寡糖转移酶AglB为对象，探讨其底物混杂性。作者比较了Hfx. volcanii、Har. marismortui、Hbt. salinarum与Hfx. mediterranei的AglB序列及预测结构，并在Hfx. volcanii缺失aglB的菌株中异源表达各来源AglB，通过LC-ESI MS/MS检测S层糖蛋白Asn-13五糖修饰恢复情况，同时用[2-3H]甘露糖标记评估功能效率。结果表明，四种AglB序列同一性为43%至72%，且后三种异源AglB均能恢复五糖修饰，证实功能互补。效率上，Har. marismortui、Hbt. salinarum与Hfx. mediterranei的AglB相对甘露糖掺入效率分别为86%、32%和70%，但Hfx. mediterranei酶表达量高出约100倍，标准化后效率不足1%。此外，首次在Hbt. salinarum脂质提取物中鉴定到DolP连接双糖及DolPP连接四糖，在Hfx. mediterranei中鉴定到DolP连接单或双N-乙酰己糖醛酸。该发现证明AglB可处理不同脂质载体与聚糖底物，但效率差异明显，为古菌N-糖基化机制及Hfx. volcanii糖工程平台开发提供了依据。
创新点
首次证明来自不同盐古菌的AglB可功能互补Hfx. volcanii AglB缺失，揭示AglB的底物混杂性；首次直接检测到Hbt. salinarum中DolPP连接聚糖及Hfx. mediterranei中DolP连接二-N-乙酰己糖醛酸。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Haloferax volcanii ΔaglB菌株 | N-糖基化通路 | aglB（来自Haloferax volcanii） | AglB | 催化 | 内源aglB缺失，由质粒表达CBD标签的Hfx. volcanii AglB，作为对照恢复N-糖基化 |
| Haloferax volcanii ΔaglB菌株 | N-糖基化通路 | aglB（来自Halobacterium salinarum） | AglB | 催化 | 异源表达于Hfx. volcanii ΔaglB菌株，能恢复S层糖蛋白五糖修饰 |
| Haloferax volcanii ΔaglB菌株 | N-糖基化通路 | aglB（来自Haloarcula marismortui） | AglB | 催化 | 异源表达于Hfx. volcanii ΔaglB菌株，能恢复S层糖蛋白五糖修饰但效率较低（32%） |
| Haloferax volcanii ΔaglB菌株 | N-糖基化通路 | aglB（来自Haloferax mediterranei） | AglB | 催化 | 异源表达于Hfx. volcanii ΔaglB菌株，表达量比对照高约100倍，但标准化后效率<1% |
关键发现
- Hfx. volcanii AglB与Har. marismortui、Hbt. salinarum、Hfx. mediterranei AglB的序列同一性分别为43%、47%、72%
- Hbt. salinarum、Har. marismortui和Hfx. mediterranei AglB均能恢复Hfx. volcanii ΔaglB菌株S层糖蛋白Asn-13的五糖修饰（MS/MS检测到m/z 1224.47 [M+2H]2+峰）
- [2-3H]甘露糖掺入效率相对Hfx. volcanii AglB（100%）分别为86%、32%和70%，其中Hfx. mediterranei AglB表达量约高100倍，标准化后效率<1%
- Hbt. salinarum脂质提取物中鉴定到C55/C60 DolP修饰双糖（己糖-己糖醛酸）及C55/C60 DolPP修饰四糖（N-乙酰己糖胺-己糖醛酸-甲基化己糖醛酸-硫酸化N-乙酰己糖胺）
- Hfx. mediterranei中鉴定到C50/C55 DolP修饰一个或两个N-乙酰己糖醛酸。
研究结论
来自不同盐古菌的AglB具有底物混杂性，能处理不同脂质载体、连接糖和组成的聚糖底物，但功能效率存在差异且有一定限度；这有助于理解古菌N-糖基化机制，并支持将Hfx. volcanii开发为糖工程平台。