Camphor Pathway Redux: Functional Recombinant Expression of 2,5-and 3,6-Diketocamphane Monooxygenases of Pseudomonas putida ATCC 17453 with Their Cognate Flavin Reductase Catalyzing Baeyer-Villiger Reactions
- 作者
- Hiroaki Iwaki, Stephan Grosse, Helene Bergeron, Hannes Leisch, Krista Morley, Yoshie Hasegawa, Peter C. K. Laub
- 单位
- Department of Life Science & Biotechnology and ORDIST, Kansai University, Osaka, Japan; National Research Council Canada, Montreal, Quebec, Canada; Departments of Chemistry and Microbiology & Immunology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada; FQRNT Centre in Green Chemistry and Catalysis, Montreal, Quebec, Canada
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology
- DOI
- 10.1128/AEM.03958-12
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
鉴定樟脑降解途径中为2,5-和3,6-二酮樟脑单加氧酶提供还原型FMN的黄素还原酶（Fred）的真实身份，并实现该双组分酶系统的功能性重组表达。
研究策略
从樟脑诱导的恶臭假单胞菌ATCC 17453中纯化Fred，通过肽序列信息克隆其编码基因；在CAM质粒上定位三个DKCMO基因；利用脉冲场凝胶电泳测定CAM质粒大小和线性；构建DKCMO与Fred的串联共表达质粒，在大肠杆菌中实现双组分系统功能性表达并进行底物谱分析。
核心内容
本研究鉴定并功能表达了恶臭假单胞菌ATCC 17453樟脑降解途径中与2,5-和3,6-二酮樟脑单加氧酶（DKCMO）偶联的专一黄素还原酶Fred。通过樟脑诱导培养纯化Fred，依据肽序列克隆其编码基因，并借助脉冲场凝胶电泳证实CAM质粒为约533 kb的线性巨型质粒。研究发现2,5-DKCMO存在两个同工酶基因（camE25-1和camE25-2）。纯化的Fred为同源二聚体，亚基分子量约18 kDa，对FMN的Km为3.6 μM，kcat为283 s⁻¹。在大肠杆菌中构建了三种DKCMO-Fred串联共表达双组分系统，均实现功能性表达。以(+)-樟脑为底物时，2,5-DKCMO-1和-2比活力分别为1.0和1.1 U/mg；3,6-DKCMO对4-乙基环己酮去对称化得到e.e. 87%的(S)-内酯，对降樟脑则专一生成"正常"内酯，e.e.达94%。上述结果明确了樟脑代谢中还原酶与单加氧酶间的电子传递配对关系，所建立的重组双组分系统为高效对映选择性Baeyer-Villiger氧化提供了新的酶工具。
创新点
首次克隆并表达了与DKCMO偶联的专一黄素还原酶Fred；发现2,5-DKCMO存在两个同工酶基因（camE25-1和camE25-2）；通过PFGE证明CAM质粒为约533 kb的线性巨型质粒；构建了三个重组DKCMO-Fred双组分系统，实现了高效对映选择性的Baeyer-Villiger氧化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida ATCC 17453 | 樟脑降解通路 | camE25-1 | 2,5-DKCMO-1 | 催化 | 催化(+)-樟脑的Baeyer-Villiger氧化；与Fred共表达时底物完全转化 |
| Pseudomonas putida ATCC 17453 | 樟脑降解通路 | camE25-2 | 2,5-DKCMO-2 | 催化 | 2,5-DKCMO同工酶，与2,5-DKCMO-1序列90%一致，同样特异于(+)-樟脑 |
| Pseudomonas putida ATCC 17453 | 樟脑降解通路 | camE36 | 3,6-DKCMO | 催化 | 特异催化(-)-樟脑的Baeyer-Villiger氧化；对降樟脑氧化专一生成正常内酯 |
| Pseudomonas putida ATCC 17453 | 樟脑降解通路 | fred | FMN还原酶（Fred） | 催化 | 同源二聚体黄素还原酶，利用NADH还原FMN，为DKCMO提供还原性FMN；Km(FMN)=3.6 μM，kcat=283 s-1 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 樟脑降解通路 | camE25-1 + fred | 2,5-DKCMO-1 + Fred | 催化 | 重组共表达系统，实现功能性Baeyer-Villiger氧化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 樟脑降解通路 | camE25-2 + fred | 2,5-DKCMO-2 + Fred | 催化 | 重组共表达系统，对2-苯基环己酮E>200 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 樟脑降解通路 | camE36 + fred | 3,6-DKCMO + Fred | 催化 | 重组共表达系统，对4-乙基环己酮去对称化得到(S)-内酯e.e. 87% |
关键发现
- 纯化的Fred为同源二聚体，亚基分子量约18,000，天然分子量37,200，对FMN的Km为3.6 μM、kcat为283 s-1，对FAD的Km为19 μM、kcat为128 s-1，NADH的Km为32 μM
- CAM质粒为线性约533 kb
- 2,5-DKCMO-1和2的比活力分别为1.0和1.1 U/mg（以(+)-樟脑为底物），3,6-DKCMO为0.81 U/mg（以(-)-樟脑为底物）
- 2,5-DKCMO-1和-2对2-苯基环己酮的(R)-对映体E值均>200，转换率分别为23%和4%
- 3,6-DKCMO对4-乙基环己酮去对称化得到(S)-内酯e.e. 87%
- 对非樟脑（降樟脑）3,6-DKCMO专一生成“正常”内酯，e.e. 94%，转换率26%。
研究结论
成功鉴定了樟脑途径中的黄素还原酶Fred，并构建了三种DKCMO与Fred的重组双组分系统，在大肠杆菌中实现功能性表达，展现出优良的对映选择性Baeyer-Villiger氧化能力；同时揭示CAM质粒是线性大质粒，且2,5-DKCMO存在两个同工酶，为樟脑代谢机制和合成应用提供了新见解。