Addition of Genes for Cellobiase and Pectinolytic Activity in Escherichia coli for Fuel Ethanol Production from Pectin-Rich Lignocellulosic Biomass
- 作者
- Meredith C. Edwards, Emily DeCrescenzo Henriksen, Lorraine P. Yomano, Brian C. Gardner, Lekh N. Sharma, Lonnie O. Ingram, Joy Doran Peterson
- 单位
- Department of Microbiology, University of Georgia, Athens, Georgia 30602; Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, Gainesville, Florida 32611
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2011）
- DOI
- 10.1128/AEM.05700-11
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
E. coli KO11 无法发酵纤维二糖和果胶，导致木质纤维素生物质（如甜菜粕）的乙醇生产需要大量昂贵的外源酶，且纤维二糖积累会抑制纤维素酶活性，增加工艺成本。
研究策略
将 Klebsiella oxytoca 的纤维二糖磷酸转移酶基因（casAB）、Erwinia chrysanthemi 的果胶酸裂解酶基因（pelE）和寡聚半乳糖醛酸裂解酶基因（ogl）以及 Sec 依赖性分泌系统（out 基因）导入 E. coli KO11，构建可同步降解纤维二糖和果胶的工程菌株，实现部分糖化与共发酵，减少外源酶用量。
核心内容
针对产乙醇大肠杆菌KO11无法利用纤维二糖和果胶、依赖昂贵外源酶的问题，研究者将产酸克雷伯菌的纤维二糖磷酸转移酶基因casAB、菊欧文氏菌的果胶酸裂解酶基因pelE、寡聚半乳糖醛酸裂解酶基因ogl及Sec依赖性分泌系统out基因导入KO11，构建了系列工程菌株。其中，整合casAB的LY40A获得纤维二糖酶活性（比活6.5~7.5 U/mg蛋白），而共表达pelE/out/ogl的JP08C实现了胞外果胶裂解酶高效分泌（比活49.3 U/mg蛋白）。在以5%甜菜粕为底物的极低酶载量发酵中，JP08C乙醇产量较KO11提高164%、较LY40A提高28%；进一步添加商业果胶甲酯酶后，JP08C最大乙醇产量从10.77 g/L提升至14.55 g/L。该策略通过赋予菌株纤维二糖利用和胞外果胶降解能力，显著提高了富含果胶原料的乙醇产率，降低了外源酶需求，为整合生物加工提供了可行路径。
创新点
['在 E. coli KO11 染色体上整合强启动子驱动的 casAB 基因，赋予菌株纤维二糖利用能力', '利用 E. chrysanthemi 的 out 基因实现 PelE 的胞外分泌，使果胶降解在胞外进行', '引入 ogl 基因将寡聚半乳糖醛酸进一步降解为可发酵单糖，提高乙醇产量', '结合商业果胶甲酯酶（PME）增强高甲酯化果胶的降解，进一步提升发酵性能']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli KO11 | 乙醇发酵 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 来自 Zymomonas mobilis，已整合于 KO11 染色体，将丙酮酸转化为乙醛 |
| Escherichia coli KO11 | 乙醇发酵 | adhB | 乙醇脱氢酶 II | 催化 | 来自 Zymomonas mobilis，已整合于 KO11 染色体，将乙醛还原为乙醇 |
| Escherichia coli LY40A | 纤维二糖代谢 | casA | 纤维二糖特异性 PTS 通透酶 IIBC | 转运 | 来自 Klebsiella oxytoca，负责纤维二糖的磷酸化转运进入细胞 |
| Escherichia coli LY40A | 纤维二糖代谢 | casB | 磷酸-β-葡萄糖苷酶 | 催化 | 来自 Klebsiella oxytoca，水解纤维二糖-6-磷酸为葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸 |
| Escherichia coli JP07 | 果胶降解 | pelE | 果胶酸裂解酶 E | 催化 | 来自 Erwinia chrysanthemi，通过 β-消除裂解聚半乳糖醛酸产生寡聚半乳糖醛酸 |
| Escherichia coli JP07C | 蛋白质分泌 | out | Sec 依赖性分泌系统 (Out 系统) | 转运 | 来自 Erwinia chrysanthemi 的 out 基因簇，介导 PelE 等蛋白的胞外分泌 |
| Escherichia coli JP08C | 果胶降解 | ogl | 寡聚半乳糖醛酸裂解酶 | 催化 | 来自 Erwinia chrysanthemi，将短链寡聚半乳糖醛酸降解为 4,5-不饱和半乳糖醛酸和半乳糖醛酸（单体） |
| Escherichia coli JP08C | 果胶降解 | — | 果胶甲酯酶 (PME) | 催化 | 商业酶（来自 Aspergillus niger），添加于发酵中，通过去甲酯化促进果胶降解 |
关键发现
- ['LY40A、JP07、JP07C 和 JP08C 均具有纤维二糖酶活性，比活在
- 5~7.5 U/mg 蛋白之间，而 KO11 无活性', 'JP07C 和 JP08C 的胞外果胶酸裂解酶比活分别为
- 9±1.2 和
- 3±0.9 U/mg 蛋白，JP07 仅为
- 2±0.3 U/mg 且不稳定，KO11 和 LY40A 无活性', '在 10% 模型糖发酵中，LY40A 乙醇产量比 KO11 增加 45%，JP07/JP07C/JP08C 比 KO11 增加约 15%', '在 5% 甜菜粕（SBP）极低酶载量发酵中，LY40A、JP07C 和 JP08C 乙醇产量显著高于 KO11；JP07C 与 LY40A 产量相近但产生更多短链寡聚半乳糖醛酸（dp≤6）', 'JP08C 的乙醇产量比 KO11 提高 164%（摘要数据），比 LY40A 提高 28%（5% SBP 发酵）', '在 10% SBP 发酵中添加商业果胶甲酯酶（PME）后，JP08C 最大乙醇产量从
- 77 g/liter 提高到
- 55 g/liter，而 LY40A 无显著变化（10.66 至
- 43 g/liter）', 'PME 添加使甲醇产量从
- 44 g/liter 升至
- 97 g/liter，同时葡萄糖和纤维二糖释放量增加，表明去甲基化促进了果胶降解']
研究结论
通过在 E. coli KO11 中引入 casAB、pelE、out 和 ogl 基因，成功构建了能利用纤维二糖和降解果胶的工程菌株，显著提高了富含果胶的木质纤维素原料（如甜菜粕）的乙醇产量，同时降低了对外源纤维素酶和果胶酶的需求，向整合生物加工迈出了重要一步。