Evidence of a Role for LytB in the Nonmegalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis
- 作者
- FRANCIS X. CUNNINGHAM, JR., TOULOUSE P. LAFOND, ELISABETH GANTT
- 单位
- Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, College Park, Maryland 20742
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2000）
- DOI
- 10.1128/JB.182.20.5841-5848.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明lytB基因在非甲羟戊酸（DOXP）途径中的作用，确定其是否参与异戊烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）合成的后期反应，并鉴定该途径尚未确定的基因。
研究策略
采用比较基因组学（基因共出现分析）和大肠杆菌番茄红素积累功能筛选两种互补策略，鉴定lytB为DOXP途径候选基因；通过在集胞藻PCC6803中进行插入失活突变、化学互补实验（IPP/DMAPP醇类似物）、以及在大肠杆菌中异源表达lytB、dxs、ipi并测定类胡萝卜素积累量，验证lytB的功能。
核心内容
该研究通过比较基因组学与功能筛选，首次实验证实lytB基因参与非甲羟戊酸（DOXP）途径的后期反应。研究者在集胞藻PCC6803中插入失活lytB，突变体生长缓慢且呈黄绿色，而添加IPP与DMAPP的醇类似物可完全恢复其正常生长，表明lytB直接参与这两种异戊二烯前体的生成。在大肠杆菌番茄红素积累体系中，来自夏侧金盏花的lytB cDNA使番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质积累分别提高至对照的约1.5倍；与dxs基因组合时，番茄红素和玉米黄质积累达到对照的338%和342%，接近两基因单独效果的乘积，而与ipi基因组合时效果与ipi单独相当。这些结果证明LytB与IPP异构酶功能相关但不同，其影响IPP与DMAPP的比值而非催化两者互变。该基因在蓝细菌和植物中均能增强类胡萝卜素积累，是代谢工程改造异戊二烯途径的重要靶点。
创新点
首次提供lytB参与DOXP途径的实验证据；证明lytB影响IPP与DMAPP的比值而非异构酶；利用IPP/DMAPP的醇类似物对集胞藻突变体进行化学互补；通过功能筛选从植物cDNA文库中克隆到lytB同源基因。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 集胞藻PCC6803 | DOXP途径（非甲羟戊酸途径） | lytB | LytB | 催化 | 启动子上游插入失活导致生长缓慢、黄绿色菌落；编码区插入致死；IPP/DMAPP醇类似物可恢复生长 |
| Escherichia coli | DOXP途径/类胡萝卜素生物合成 | lytB (Adonis aestivalis cDNA) | LytB | 催化 | 增强番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质积累约1.5倍 |
| Escherichia coli | DOXP途径 | dxs (万寿菊 cDNA) | DXS (1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶) | 催化 | 单独表达使类胡萝卜素积累提高约2.1倍；与lytB组合达338% |
| Escherichia coli | DOXP途径 | ipi (拟南芥 cDNA) | IPI (异戊烯基二磷酸异构酶) | 催化 | 单独表达提高约2.05倍；与lytB组合无协同效应，表明LytB影响IPP/DMAPP比例 |
| Escherichia coli | 番茄红素生物合成 | crtE, crtB, crtI | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | pAC-LYC质粒编码，用于番茄红素报告系统 |
关键发现
- lytB基因启动子上游插入失活的集胞藻PCC6803突变体生长缓慢，菌落呈黄绿色且易漂白
- 编码区插入致死。添加3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯-1-醇（IPP和DMAPP的醇类似物，各2.5 mM）可完全恢复其生长，菌落呈正常深蓝绿色。在产番茄红素的大肠杆菌中，Adonis aestivalis的lytB cDNA使番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质积累分别提高至对照的152%±7%、149%±2%和149%±2%（约1.5倍）
- 集胞藻lytB基因同样提高约1.5倍。万寿菊dxs cDNA和拟南芥ipi cDNA单独表达分别使番茄红素积累提高至209%±8%和205%±9%。lytB与dxs组合使番茄红素和玉米黄质积累达到338%±23%和342%±32%，接近两者单独效果相乘
- ipi与dxs组合为355%±14%和345%±29%
- 但lytB与ipi组合（203%±16%）与ipi单独效果无显著差异，表明LytB影响IPP/DMAPP比例而非异构酶。在薄荷腺毛cDNA文库中，lytB EST频率为11/1316（0.84%），与dxs相同。基因组共出现分析显示，lytB和gcpE是与已知DOXP途径基因分布模式匹配的主要候选基因。
研究结论
lytB编码DOXP途径中一个位于分支点或之后的酶，参与IPP和DMAPP的生成；其功能与IPP异构酶(ipi)相关但不相同，影响IPP/DMAPP比例；该基因在植物和蓝细菌中均能增强大肠杆菌的类胡萝卜素积累，是代谢工程改造异戊二烯途径的重要靶点。