A Gene Cluster for the Mevalonate Pathway from Streptomyces sp. Strain CL190
- 作者
- Motoki Takagi, Tomohisa Kuzuyama, Shunji Takahashi, Haruo Seto
- 单位
- Institute of Molecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0032, Japan
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2000）
- DOI
- 10.1128/JB.182.15.4153-4157.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并功能验证Streptomyces sp. strain CL190中编码甲羟戊酸途径的基因簇，证明该基因簇能在异源宿主E. coli中重建甲羟戊酸途径。
研究策略
通过基因组文库筛选获得含有hmgr基因侧翼区域的6.7 kb DNA片段并进行序列分析，将完整基因簇克隆到pUC118质粒（pUMV19）并在E. coli JM109中表达；利用[1-13C]乙酸喂养实验和NMR分析检测泛醌标记模式，同时利用fosmidomycin（非甲羟戊酸途径特异抑制剂）抗性实验验证甲羟戊酸途径的运作。
核心内容
该研究从链霉菌CL190中鉴定并功能验证了一个完整的甲羟戊酸途径基因簇。通过基因组文库筛选获得含hmgr侧翼区域的6.7 kb DNA片段，序列分析确定其包含hmgr及orfA-E五个开放阅读框，并依据同源性分别将orfA、orfB、orfC、orfE注释为甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和HMG-CoA合酶。将完整基因簇克隆至pUC118质粒并在大肠杆菌JM109中表达，[1-13C]乙酸喂养结合NMR分析显示泛醌异戊烯基单元C-1位13C丰度为1.6%、C-3位为4.6%，证实异源宿主中甲羟戊酸途径成功运作；含该质粒的菌株可在含20 μg/ml fosmidomycin的培养基上生长，而对照不能。缺失orfD的质粒使菌株OD660仅为1.0，完整基因簇菌株可达2.5，表明orfD对途径充分运作不可或缺。该工作首次在大肠杆菌中功能性表达真细菌来源的完整甲羟戊酸途径基因簇，为利用该途径进行异源类异戊二烯化合物生产及构建途径缺陷型菌株奠定了基础。
创新点
首次在E. coli中功能性表达并验证了一个真细菌来源的完整甲羟戊酸途径基因簇；明确了orfA、orfB、orfC、orfE分别编码甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和HMG-CoA合酶，并发现orfD对途径的充分运作是必需的。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces sp. strain CL190 | 甲羟戊酸途径 | hmgr, orfA, orfB, orfC, orfD, orfE | — | — | 基因簇来源菌株，该菌天然同时利用甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | hmgr | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 甲羟戊酸途径限速酶，EC 1.1.1.34，来自Streptomyces sp. CL190 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | orfA | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | EC 2.7.1.36，与M. jannaschii甲羟戊酸激酶同源 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | orfB | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | EC 4.1.1.33，与S. cerevisiae同源 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | orfC | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | EC 2.7.4.2，与S. cerevisiae磷酸甲羟戊酸激酶同源 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | orfD | 功能未知蛋白 | — | 与Erwinia herbicola Eho10中ORF6同源，缺失后途径效率降低，具体功能未定 |
| Escherichia coli JM109 | 甲羟戊酸途径 | orfE | HMG-CoA合酶 | 催化 | EC 4.1.3.5，与A. thaliana HMG-CoA合酶同源 |
关键发现
- 序列分析发现6.7 kb片段含有hmgr及orfA-E，其中orfA编码345个氨基酸（与M. jannaschii甲羟戊酸激酶26%同源性），orfB编码350个氨基酸（与S. cerevisiae二磷酸甲羟戊酸脱羧酶34%同源性），orfC编码374个氨基酸（可能为磷酸甲羟戊酸激酶，与S. cerevisiae该酶26.8%同源性），orfD编码363个氨基酸（与E. herbicola未知蛋白ORF6同源），orfE编码389个氨基酸（与A. thaliana HMG-CoA合酶28%同源性）
- [1-13C]乙酸喂养实验显示，表达pUMV19的E. coli JM109中泛醌异戊烯基单元C-1位13C丰度为1.6%，C-3位为4.6%，证明甲羟戊酸途径运行
- 含pUMV19的JM109在含20 μg/ml fosmidomycin的M9培养基上经IPTG诱导可生长，而对照不能
- 缺失orfD的pUMV19ΔM菌株在液体培养基中OD660仅为1.0或更低，而完整pUMV19菌株OD660可达2.5，说明orfD对途径充分运作必要。
研究结论
Streptomyces sp. strain CL190基因组中hmgr与orfABCDE构成一个甲羟戊酸途径基因簇，其中orfA、orfB、orfC、orfE分别编码甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶和HMG-CoA合酶，orfD功能尚不明确但影响途径效率；该基因簇在E. coli中异源表达可赋予菌株利用甲羟戊酸途径合成IPP的能力，可用于构建非甲羟戊酸途径缺陷型突变株。