FabG, an NADPH-Dependent 3-Ketoacyl Reductase of Pseudomonas aeruginosa, Provides Precursors for Medium-Chain-Length Poly-3-Hydroxyalkanoate Biosynthesis in Escherichia coli
- 作者
- QUN REN, NICOLAS SIERRO, BERNARD WITHOLT, BIRGIT KESSLER
- 单位
- Institute of Biotechnology, ETH Honggerberg, CH-8093 Zürich, Switzerland
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2000）
- DOI
- 10.1128/JB.182.10.2978-2981.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
铜绿假单胞菌的FabG是否能作为NADPH依赖的3-酮脂酰-CoA还原酶，为大肠杆菌中合成中链聚-3-羟基链烷酸酯（mcl-PHA）提供前体。
研究策略
将铜绿假单胞菌的fabG基因克隆并在不同大肠杆菌菌株（含fadR、fadA、fadB等突变）中与PHA聚合酶基因phaC共表达，通过体内PHA积累和体外酶活测定验证FabG的功能。
核心内容
该研究首次实验证实了铜绿假单胞菌的FabG蛋白具有NADPH依赖的中链3-酮脂酰-CoA还原酶活性，能够将脂肪酸β-氧化产生的中间体转化为R-3-羟基脂酰-CoA，为大肠杆菌中中链聚-3-羟基链烷酸酯（mcl-PHA）的合成提供前体。研究者将铜绿假单胞菌的fabG基因与PHA聚合酶基因phaC共表达于多种大肠杆菌菌株中，并通过体内PHA积累和体外酶活测定验证功能。体外酶活测定显示重组大肠杆菌中FabG的还原酶活性为50–90 mU/mg蛋白，显著高于对照的10–20 mU/mg。在含fadR和fadA突变的MF4100和RS3338菌株中，共表达fabG和phaC使PHA含量分别达到2.8%和3.1%，而仅表达phaC时不足0.1%。在fadA突变株JMU194中，PHA含量从14.2%提升至20.6%，效果最为显著。PHA组成以3-羟基辛酸为主（65–91%），聚合物分子量介于51,100–68,300之间。该研究揭示了脂肪酸β-氧化与PHA合成之间的代谢连接，为利用β-氧化中间体在大肠杆菌中高效生产mcl-PHA提供了新的代谢工程策略。
创新点
首次实验证明铜绿假单胞菌FabG具有针对中链3-酮脂酰-CoA的还原酶活性，能够利用β-氧化中间体为mcl-PHA合成提供前体；在E. coli fadA突变株中显著提高了PHA产量。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 脂肪酸β-氧化 | fabG | FabG | 催化 | 来自铜绿假单胞菌的NADPH依赖3-酮脂酰-CoA还原酶，将中链3-酮脂酰-CoA还原为3-羟基脂酰-CoA |
| Escherichia coli | 聚-3-羟基链烷酸酯合成 | phaC2 | PhaC2 | 催化 | 来自恶臭假单胞菌Gpo1的PHA聚合酶，聚合3-羟基脂酰-CoA为mcl-PHA |
| Escherichia coli | 脂肪酸β-氧化 | fadB | FadB | 催化 | fadB突变体JMU193，阻断3-羟基脂酰-CoA脱氢酶，减少酮脂酰-CoA |
| Escherichia coli | 脂肪酸β-氧化 | fadA | FadA | 催化 | fadA突变体JMU194，阻断酮脂酰-CoA硫解酶，增加酮脂酰-CoA积累 |
| Escherichia coli | 脂肪酸β-氧化调控 | fadR | FadR | 调控 | fadR突变使β-氧化基因组成型表达 |
关键发现
FabG在重组大肠杆菌中具有3-酮脂酰-CoA还原酶活性（50-90 mU/mg蛋白，对照10-20 mU/mg）。MF4100和RS3338菌株同时表达phaC和fabG时，PHA含量分别为2.8%和3.1%（仅表达phaC时<0.1%）。JMU193（fadB突变）中PHA含量从4.6%增至5.2%，JMU194（fadA突变）中从14.2%增至20.6%。PHA组成主要为3-羟基辛酸（65-91%），还有3-羟基己酸和3-羟基癸酸。聚合物分子量在51,100-68,300之间。
研究结论
铜绿假单胞菌的FabG能够将β-氧化产生的中链3-酮脂酰-CoA还原为R-3-羟基脂酰-CoA，为PHA聚合酶提供底物，从而在大肠杆菌中实现mcl-PHA的合成。在fadA突变体中效果最显著，证实了FabG通过该途径提供前体。