Isolation and Characterization of Canthaxanthin Biosynthesis Genes from the Photosynthetic Bacterium Bradyrhizobium sp. Strain ORS278
- 作者
- LAURE HANNIBAL, JEAN LORQUIN, NICOLAS ANGLES D'ORTOLI, NELLY GARCIA, CLEMENTE CHAINTREUIL, CATHERINE MASSON-BOIVIN, BERNARD DREYFUS, ERIC GIRAUD
- 单位
- Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes, IRD, CIRAD, AGRO-M, INRA, 34398 Montpellier, France; Laboratoire de Microbiologie des sols, IRD/ISRA, 1386 Dakar, Senegal
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2000）
- DOI
- 10.1128/JB.182.13.3850-3853.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从光合细菌Bradyrhizobium sp. strain ORS278中分离和鉴定参与角黄素（canthaxanthin）生物合成的基因簇，并验证其功能。
研究策略
利用crtB和crtI保守区域设计简并引物进行PCR扩增，筛选cosmid文库获得含类胡萝卜素基因簇的克隆；通过序列分析鉴定开放阅读框；在大肠杆菌中通过互补实验验证各基因功能。
核心内容
该研究从光合细菌Bradyrhizobium sp. ORS278中分离并鉴定了角黄素生物合成基因簇。研究人员基于crtB和crtI保守区域设计简并引物进行PCR扩增，筛选cosmid文库获得含目标基因簇的克隆，经序列分析鉴定出crtE、crtY、crtI、crtB、crtW五个基因，并通过在大肠杆菌中的异源互补实验逐一验证其功能。结果显示，ORS278中角黄素占总类胡萝卜素含量的85%，含量达1.43 mg/g干重；将完整基因簇（pSTM78）引入积累GGPP的大肠杆菌宿主后，产物为100%角黄素，产量95.4 μg/g干重；而用携带crtW的质粒互补累积β-胡萝卜素的宿主时，角黄素占比90%，产量达800 μg/g干重。这五个基因均具有催化活性，且crtY、crtI、crtB紧密连锁。该工作首次在光合细菌中报道了环状类胡萝卜素生物合成基因簇的克隆与功能验证，为后续利用该基因簇构建高产角黄素的重组菌株奠定了遗传基础。
创新点
首次在光合细菌中报道了环状类胡萝卜素（角黄素）生物合成基因簇的克隆和表征；明确了crtE、crtY、crtI、crtB、crtW五个基因的功能，并证明它们能够在大肠杆菌中驱动角黄素合成。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 角黄素生物合成途径 | crtE | GGPP合成酶（香叶基香叶基焦磷酸合成酶） | 催化 | 来自Bradyrhizobium sp. ORS278，在大肠杆菌中互补验证可产生β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 角黄素生物合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自Bradyrhizobium sp. ORS278，催化番茄红素转化为β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 角黄素生物合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Bradyrhizobium sp. ORS278，与crtB共同作用产生番茄红素 |
| Escherichia coli | 角黄素生物合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 来自Bradyrhizobium sp. ORS278，催化GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli | 角黄素生物合成途径 | crtW | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Bradyrhizobium sp. ORS278，催化β-胡萝卜素转化为角黄素，在E. coli中表达可产生90%角黄素（800 μg/g干重） |
关键发现
- Bradyrhizobium sp. ORS278中角黄素占总类胡萝卜素含量的85%，含量为1.43 mg/g干重
- 分离到的基因簇包含crtE、crtY、crtI、crtB、crtW五个基因，其中crtY、crtI、crtB紧密连锁
- 在大肠杆菌中，当引入完整基因簇（pSTM78）到积累GGPP的宿主时，产生100%角黄素，产量为95.4 μg/g干重
- 用携带crtW的pSTM51互补累积β-胡萝卜素的宿主时，产生90%角黄素，产量达800 μg/g干重
- 功能验证表明crtE、crtY、crtI、crtB、crtW均具有催化活性。
研究结论
成功分离并表征了来自Bradyrhizobium sp. ORS278的角黄素生物合成基因簇，所有关键基因功能均经异源表达验证，为利用该基因簇构建高产角黄素的重组菌株提供了基础。