1-Deoxy-d-Xylulose 5-Phosphate Synthase, the Gene Product of Open Reading Frame (ORF) 2816 and ORF 2895 in Rhodobacter capsulatus
- 作者
- Frederick M. Hahn, Lisa M. Eubanks, Charles A. Testa, Brian S. J. Blagg, Jonathan A. Baker, C. Dale Poulter
- 单位
- Department of Chemistry, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.1.1-11.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）中编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXP合酶）的两个开放阅读框（ORF 2816和ORF 2895），并对其基因产物进行克隆、表达、纯化和酶学表征，同时验证其体内功能。
研究策略
通过序列同源性搜索在R. capsulatus基因组中发现两个候选dxs基因；将带有组氨酸标签的基因在大肠杆菌中异源表达，经Ni-NTA亲和层析纯化至95%以上纯度；开发基于放射性标记的酶活测定方法，进行稳态动力学分析；构建大肠杆菌dxs基因敲除株，利用质粒互补实验验证dxsB的功能。
核心内容
荚膜红细菌基因组中通过序列同源搜索发现两个编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXP合酶）的候选基因dxsA（ORF 2816）和dxsB（ORF 2895），分别位于光合作用基因簇内和染色体其他位置。将带组氨酸标签的两个基因在大肠杆菌中异源表达，经Ni-NTA亲和层析纯化至95%以上纯度，并开发了基于放射性标记的酶活测定方法进行稳态动力学分析。结果显示两种酶均为同源二聚体，亚基分子量约68 kDa；在pH 7.4的柠檬酸钠缓冲液中，DXP合酶A对丙酮酸的Km为0.61 mM、对GAP的Km为150 μM、Vmax为1.9 μmol/min/mg，DXP合酶B对应参数分别为3.0 mM、120 μM和1.4 μmol/min/mg。序列比对显示二者具有64.3%的一致性。更重要的是，dxsB能互补大肠杆菌dxs敲除株FH11在非允许温度下的生长，证明其编码功能性DXP合酶。这一基因冗余可能与该菌适应光合与呼吸两种生长模式中对异戊二烯前体需求的差异化调控有关。
创新点
首次报道R. capsulatus含有两个编码DXP合酶的基因（dxsA和dxsB），其中dxsA位于光合作用基因簇内；开发了一种新的DXP合酶活性测定方法；鉴定出DXP合酶特有的DRAG保守序列；通过互补实验证明dxsB在体内具有DXP合酶功能。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP途径 | dxsA (ORF 2816) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶A | 催化 | 在大肠杆菌中异源表达并纯化，测定了Km和Vmax |
| Escherichia coli FH11 (dxs敲除株) | MEP途径 | dxsB (ORF 2895) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶B | 催化 | 质粒携带dxsB互补E. coli dxs敲除株，验证体内功能 |
| Rhodobacter capsulatus | MEP途径 | dxsA (ORF 2816) 和 dxsB (ORF 2895) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶A和B | 催化 | 天然含有两个DXP合酶基因，dxsA位于光合基因簇，dxsB位于染色体其他位置 |
关键发现
- 在大肠杆菌中成功表达并纯化了R. capsulatus DXP合酶A和B，纯度>95%。DXP合酶A为同源二聚体，亚基分子量68 kDa。稳态动力学参数（200 mM柠檬酸钠缓冲液，pH 7.4）：DXP合酶A对丙酮酸的Km=0.61 mM，对GAP的Km=150 μM，Vmax=1.9 μmol/min/mg
- DXP合酶B对丙酮酸的Km=3.0 mM，对GAP的Km=120 μM，Vmax=1.4 μmol/min/mg。此外，dxsB（ORF 2895）能互补大肠杆菌dxs敲除菌株FH11在非允许温度下的生长，而dxsA未做互补实验。序列分析显示DXP合酶A和B具有64.3%的一致性（622个残基中402个相同）。
研究结论
荚膜红细菌具有两个功能性DXP合酶基因dxsA和dxsB，分别位于光合作用基因簇和染色体其他位置。两个重组酶的动力学性质相似但参数不同，dxsB可互补大肠杆菌dxs缺失突变，证明其编码功能性DXP合酶。这种基因冗余可能与该菌在光合与呼吸两种生长模式下对异戊二烯前体的需求调节有关。