Characterization of the Gene Cluster Involved in Isoprene Metabolism in Rhodococcus sp. Strain AD45
- 作者
- JOHAN E. T. VAN HYLICKAMA VLIEG, HANS LEEMHUIS, JEFFREY H. LUTJE SPELBERG, DICK B. JANSSEN
- 单位
- Department of Biochemistry, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, NL-9747 AG Groningen, The Netherlands
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2000）
- DOI
- 10.1128/JB.182.7.1956-1963.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示Rhodococcus sp. strain AD45中异戊二烯降解相关基因簇的组成和功能，阐明异戊二烯代谢途径的分子机制。
研究策略
通过PCR扩增、基因组文库构建、Southern杂交、序列分析、异源表达及酶活测定，鉴定并表征异戊二烯代谢基因簇isoABCDEFGHIJ。
核心内容
该研究对Rhodococcus sp. strain AD45中负责异戊二烯降解的基因簇进行了系统的分子表征。通过PCR扩增、基因组文库构建、Southern杂交及序列分析，鉴定出一个长8456 bp的DNA片段，包含10个开放阅读框（isoABCDEFGHIJ），GC含量为58.9%。异源表达和酶活测定表明，IsoJ作为第二个谷胱甘肽S-转移酶，在大肠杆菌中表达量占总可溶蛋白的35%，对CDNB的比活力为9.0 mmol min⁻¹ mg⁻¹；而IsoI不与常规底物反应，对1,2-环氧-2-甲基-3-丁烯的比活力估计为6–10 μmol min⁻¹ mg⁻¹，约为天然纯化酶的1/6至1/7，且该酶介导的环氧化反应具有高度对映选择性（产物对映体过量95%）。综合酶学特征与序列信息，研究提出了异戊二烯的完整分解代谢模型：异戊二烯经单加氧酶（由isoABCDEF编码）氧化为环氧化物，再由IsoI催化与谷胱甘肽结合，随后经脱氢酶IsoH等步骤进入β-氧化。该工作首次完整报道了异戊二烯代谢基因簇的序列，为理解微生物降解挥发性烯烃的分子机制及异戊二烯的生物转化应用奠定了基础。
创新点
首次完整报道异戊二烯代谢基因簇的核苷酸序列；发现第二个谷胱甘肽S-转移酶IsoJ；提出包含环氧化、谷胱甘肽结合、氧化和β-氧化的完整分解代谢途径模型。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoA | IsoA | 催化 | 推测为烯烃单加氧酶α亚基 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoB | IsoB | 催化 | 推测为烯烃单加氧酶β亚基 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoC | IsoC | 催化 | Rieske型铁氧还蛋白，介导电子传递 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoD | IsoD | 调控 | 调节/效应蛋白，影响反应速率或产物分布 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoE | IsoE | 催化 | 推测为烯烃单加氧酶γ亚基 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoF | IsoF | 催化 | NADH依赖性还原酶，双铁双硫黄素蛋白 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoG | IsoG | 催化 | 推测的α-甲基酰基辅酶A消旋酶，与小鼠α-甲基酰基CoA消旋酶同源 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoH | IsoH | 催化 | NAD⁺依赖的1-羟基-2-谷胱甘肽基-2-甲基-3-丁烯脱氢酶，属于短链脱氢酶/还原酶家族 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoI | IsoI | 催化 | 谷胱甘肽S-转移酶，对1,2-环氧-2-甲基-3-丁烯有活性 |
| Rhodococcus sp. strain AD45 | 异戊二烯降解途径 | isoJ | IsoJ | 催化 | 第二个谷胱甘肽S-转移酶，对CDNB和DCNB有活性，推测可能作用于下游CoA硫酯 |
关键发现
- 测序得到8456 bp DNA片段，含10个ORF（isoABCDEFGHIJ），GC含量58.9%；IsoJ在大肠杆菌中表达水平占总可溶蛋白35%，对CDNB的活性为9.0 mmol min⁻¹ mg⁻¹（pH
- 0），对DCNB的活性为6.4（pH
- 0）和0.20（pH
- 5）mmol min⁻¹ mg⁻¹；IsoI不与CDNB/DCNB反应，对1,2-环氧-2-甲基-3-丁烯的比活力估计为6-10 μmol min⁻¹ mg⁻¹（pH
- 5），约为天然纯化酶的1/6-1/7；异戊二烯单加氧酶催化生成(R)-1,2-环氧-2-甲基-3-丁烯的对映体过量95%、苯乙烯氧化物87%、对氯苯乙烯59%；isoI基因在基因组中为单拷贝。
研究结论
异戊二烯降解途径为：异戊二烯被单加氧酶（isoABCDEF）氧化为1,2-环氧-2-甲基-3-丁烯，再由谷胱甘肽S-转移酶IsoI催化生成HGMB，经脱氢酶IsoH氧化为GMBA，后续可能通过CoA硫酯化和β-氧化进一步代谢；IsoG可能参与α-甲基消旋，IsoJ的生理功能尚待确定。