An Archaeological Photosignal-Transducing Module Mediates Phototaxis in Escherichia coli
- 作者
- Kwang-Hwan Jung, Elena N. Spudich, Vishwa D. Trivedi, John L. Spudich
- 单位
- Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Texas—Houston Medical School, Houston, Texas 77030
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.21.6365-6371.2001
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
验证古菌光敏信号转导模块（NpSRII-NpHtrII的七螺旋跨膜部分）是否能作为一个模块化功能单元，在与真细菌趋化转导子细胞质域融合后，在异源底盘（Escherichia coli）中传递光信号并介导光趋化反应。
研究策略
构建NpSRII与NpHtrII之间以短柔性连接肽连接的融合蛋白，并将该融合蛋白的细胞质部分替换为沙门氏菌Tar或大肠杆菌Tsr的细胞质域得到嵌合蛋白；分别在H. salinarum和E. coli中异源表达，通过光闪烁吸收光谱、吸收谱、SDS-PAGE和运动行为分析评估功能。
核心内容
该研究构建了古菌光敏信号转导模块NpSRII-NpHtrII的融合蛋白，并将其与沙门氏菌Tar或大肠杆菌Tsr的细胞质趋化域融合，形成嵌合受体，分别在盐杆菌和大肠杆菌中异源表达。在盐杆菌中，融合蛋白以每细胞1.6×10⁴分子的水平表达，介导正常光排斥反应，刺激后约400毫秒出现反转频率峰值；纯化蛋白吸收峰为501纳米，O中间体衰变半衰期约362毫秒。在大肠杆菌中，NpSRII-NpHtrII-StTar嵌合体表达量为每细胞1.4×10⁴分子，吸收峰为503纳米，Tar-M嵌合体介导光抑制翻滚的吸引反应，而Tsr-M嵌合体介导光增强翻滚的排斥反应，且均依赖视黄醛。这一结果表明，古菌七螺旋跨膜光受体-转导子模块可作为独立信号转导单元，与远缘真细菌趋化细胞质域有效耦合，证实了跨膜螺旋-螺旋接触传递信号的模型，为模块化光遗传工具设计提供了早期范例。
创新点
['首次构建并表达NpSRII-NpHtrII融合蛋白，证明其保留了天然的信号转导功能', '将古菌光受体-转导子跨膜模块与真细菌趋化转导子细胞质域融合，在大肠杆菌中实现了视黄醛依赖的光趋化反应', '证明九螺旋跨膜结构是独立的光信号转导模块，支持SR-Htr通过跨膜螺旋-螺旋接触进行信号转导的模型']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Natronobacterium pharaonis (基因来源) | 光趋化信号转导 | npsRII, nphtrII | NpSRII, NpHtrII | 调控 | 天然的受体-转导子对，NpSRII为光受体，NpHtrII为转导子 |
| Halobacterium salinarum Pho81Wr- | 光趋化信号转导 | npsRII-nphtrII (融合基因) | NpSRII-NpHtrII融合蛋白 | 调控 | 融合蛋白在古菌中表达，介导正常的排斥光趋化反应 |
| Escherichia coli RP437 | 趋化信号转导 (异源光趋化) | npsRII-nphtrII-tar / npsRII-nphtrII-tsr (嵌合基因) | NpSRII-NpHtrII-StTar / NpSRII-NpHtrII-EcTsr嵌合蛋白 | 调控 | 嵌合蛋白在E. coli中实现视黄醛依赖的光吸引或排斥反应，耦合到CheW/A/Y系统 |
| Escherichia coli UT5600 | 蛋白表达 | npsRII-nphtrII-sttar | NpSRII-NpHtrII-StTar融合蛋白 | 调控 | 用于膜制备和蛋白纯化，表达量约0.8-1.0 mg/L |
关键发现
- NpSRII-NpHtrII融合蛋白在H. salinarum中表达量为1.6×10^4分子/细胞，在E. coli中NpSRII-NpHtrII-StTar嵌合体表达量为1.4×10^4分子/细胞
- 纯化产量分别为1.0 mg/L（H. salinarum）和0.8-1.0 mg/L（E. coli）。融合蛋白在H. salinarum膜中的O中间体衰变半衰期为362 ms，E. coli膜中嵌合体为365 ms（在1%辛基葡萄糖苷条件下）
- 在相同条件下（4M NaCl+1%辛基葡萄糖苷）分别为694 ms和640 ms。纯化蛋白吸收峰分别为501 nm（H. salinarum融合）和503 nm（E. coli嵌合）。行为学上，H. salinarum中融合蛋白介导正常排斥反应（刺激后约400 ms出现反转频率峰值）
- E. coli中，Tar-M嵌合体介导吸引反应（光抑制翻滚），Tsr-M嵌合体介导排斥反应（光增强翻滚），Tar-G和Tsr-G产生弱排斥，P融合无响应
- 无视黄醛时无光反应。
研究结论
古菌NpSRII-NpHtrII的七螺旋跨膜部分构成一个模块化的光信号转导单元，能够与远缘真细菌的趋化细胞质域耦合，在大肠杆菌中产生视黄醛依赖的光趋化反应，证实SR-Htr通过跨膜螺旋-螺旋接触进行物理和功能相互作用的模型。