Monitoring Intracellular Levels of XylR in Pseudomonas putida with a Single-Chain Antibody Specific for Aromatic-Responsive Enhancer-Binding Proteins
- 作者
- SOFÍA FRAILE, FERNANDO RONCAL, LUIS A. FERNÁNDEZ, VÍCTOR DE LORENZO
- 单位
- Centro Nacional de Biotecnología del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.19.5571-5579.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
直接定量 Pseudomonas putida 中由天然启动子表达的 XylR 蛋白的细胞内水平，以验证其转录自调控模型并揭示蛋白稳定性调控机制。
研究策略
利用免疫小鼠脾细胞构建 scFv 噬菌体展示文库，经多轮淘选获得高亲和力的单链抗体 Phab B7；通过 Western blot 结合化学发光定量，检测不同生长阶段和芳香族诱导物条件下 P. putida 细胞内 XylR 和 XylRΔA 的分子数。
核心内容
为直接验证恶臭假单胞菌中XylR蛋白的转录自调控模型并揭示其稳定性调控机制，该研究利用免疫小鼠脾细胞构建了scFv噬菌体展示文库，经多轮淘选获得特异性识别芳香族响应型增强子结合蛋白的单链抗体Phab B7，其识别表位为TPRAQATLLRVL且两个精氨酸为关键残基，检测限约0.5 ng，优于多克隆血清。通过Western blot结合化学发光定量，研究测定了不同生长阶段和诱导物条件下细胞内XylR及截短型XylRΔA的绝对分子数：在MAD1中指数期XylR约28±5分子/细胞、稳定期升至142±12分子/细胞；MAD2中XylRΔA对应为90±9和575±66分子/细胞，约为野生型的4倍。加入2 mM诱导剂3-MBA后，稳定期XylR降至约58±10分子/细胞（下降超过2.5倍），指数期则无显著变化。结果表明XylR蛋白浓度受生长阶段和诱导物的显著调节，与自调控模型一致，并提示体内存在控制XylR蛋白稳定性的机制。
创新点
首次获得特异性识别 XylR 类芳香族响应型增强子结合蛋白的单链抗体 Phab B7；首次直接测得细胞内 XylR 蛋白的绝对分子数，并揭示其随生长阶段和诱导物存在的波动。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida MAD1 | TOL 质粒 Pu 启动子（芳香烃降解途径） | xylR | XylR | 调控 | 野生型 XylR，由天然 Pr 启动子表达，响应 3-甲基苄醇等芳香族效应物 |
| Pseudomonas putida MAD2 | TOL 质粒 Pu 启动子（芳香烃降解途径） | xylRΔA（xylR 的 N 端截短） | XylRΔA | 调控 | 组成型活性突变体，缺失 N 端 223 个氨基酸，无需诱导物即可激活 Pu |
| Pseudomonas stutzeri OX1 | 邻二甲苯降解途径 | touR | TouR | 调控 | 调控邻二甲苯单加氧酶操纵子的增强子结合蛋白，其 C 端区域用于免疫小鼠以制备抗体 |
关键发现
- Phab B7 可识别表位 TPRAQATLLRVL，其中两个精氨酸残基为关键
- 检测限约 0.5 ng TouRΔA，优于多克隆血清（2.5 ng）。在 P. putida MAD1 中，指数期 XylR 约 28±5 分子/细胞，稳定期约 142±12 分子/细胞
- 在 MAD2 中，指数期 XylRΔA 约 90±9 分子/细胞，稳定期约 575±66 分子/细胞。加入 2 mM 诱导剂 3-MBA 后，稳定期 XylR 水平降至约 58±10 分子/细胞（下降 >2.5 倍），指数期无明显变化（约 27±6）。XylRΔA 水平约为野生型 XylR 的 4 倍。
研究结论
XylR 蛋白的细胞内浓度受生长阶段和芳香族诱导物的显著调节，与现有的转录自调控模型一致，并提示存在控制 XylR 蛋白稳定性的体内机制。