Molecular Physiology of Sugar Catabolism in Lactococcus lactis IL1403
- 作者
- Sergine Even, Nic D. Lindley, Muriel Cocaign-Bousquet
- 单位
- Centre de Bioingénierie Gilbert Durand, UMR 5504 INSA/CNRS and UMR 792 INSA/INRA, Institut National des Sciences Appliquées, 31077 Toulouse Cedex 4, France
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.13.3817-3824.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析乳酸乳球菌IL1403在葡萄糖和半乳糖两种碳源、两种营养复杂度培养基下，糖分解代谢的生理特性，特别是分解代谢通量控制及基因表达（转录和翻译）的调控机制。
研究策略
通过测定生长动力学、比速率、胞内代谢物浓度、酶活以及采用新型地高辛标记RNA的DNA宏阵列技术进行转录组分析，并构建速率模型比较转录本浓度与酶合成速率，以区分转录和翻译水平的调控贡献。
核心内容
该研究系统解析了乳酸乳球菌IL1403在葡萄糖与半乳糖两种碳源及两种营养复杂度培养基下的糖分解代谢生理特性。通过测定生长动力学、比速率、胞内代谢物浓度和酶活，并采用地高辛标记RNA的DNA宏阵列技术进行转录组分析，结合速率模型区分转录与翻译水平的调控贡献。结果显示，所有培养条件下均维持同型乳酸发酵，>90%碳回收为乳酸；半乳糖下生长速率为0.17 h-1，显著低于葡萄糖的0.55 h-1。添加莫能菌素不能提高糖消耗速率，结合低胞内代谢物浓度和高体外酶活性，推测糖转运为限速步骤。关键发现是翻译效率在葡萄糖培养细胞中平均比半乳糖高3倍，表明存在糖依赖的翻译调控。转录调控幅度较小（<3倍），而糖酵解基因在葡萄糖下表达升高，混合酸途径基因表达降低。该研究揭示了糖分解代谢通量受糖转运限制，且转录-翻译协同调控维持酶浓度，混合酸途径低通量可能与乙醇脱氢酶活性不足及丙酮酸甲酸裂解酶稳定性差有关。
创新点
采用地高辛化学标记RNA结合碱性磷酸酶-抗地高辛偶联物进行DNA宏阵列检测，实现无需放射性标记的转录定量；揭示了葡萄糖与半乳糖培养下翻译效率存在系统性差异（葡萄糖较半乳糖平均高3倍）。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | glk | 葡萄糖激酶 | 催化 | 葡萄糖磷酸化，酶活在半乳糖和葡萄糖下差异不大 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | pgi | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | 受无机磷影响Km，转录表达水平相似 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | pfk | 磷酸果糖激酶 | 催化 | 葡萄糖下转录水平较高 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | fba | 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 | 催化 | 葡萄糖下转录水平较高，受无机磷影响底物亲和力 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | tpi | 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | 葡萄糖下酶活及转录水平较高 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | gap | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 关键调控酶，受NADH/NAD抑制，转录水平在各条件下相近 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | pgk | 3-磷酸甘油酸激酶 | 催化 | 转录水平相近，酶活略有差异 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | pgm | 磷酸甘油酸变位酶 | 催化 | 葡萄糖下酶活较高，转录水平相近 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | eno | 烯醇化酶 | 催化 | 葡萄糖下酶活和转录水平较高 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解 | pyk | 丙酮酸激酶 | 催化 | 属于las操纵子，葡萄糖下转录水平显著升高（MS10R比值2.3） |
| Lactococcus lactis IL1403 | 乳酸发酵 | ldh | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 属于las操纵子，葡萄糖下转录水平升高，受NADH/NAD抑制 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 混合酸发酵 | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 属于las操纵子，半乳糖下转录水平较高，但酶活极低，可能稳定性差 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 混合酸发酵 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 半乳糖下转录水平较高，酶活也较高 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 混合酸发酵 | ack | 乙酸激酶 | 催化 | 半乳糖下转录水平较高，可能受CcpA负调控 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 混合酸发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 半乳糖下转录水平显著较高（MS10R比值0.4），酶活较低，可能限制混合酸通量 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 糖酵解/分解代谢调控 | ccpA | 分解代谢物控制蛋白A | 调控 | 转录调节因子，在半乳糖MS10R下表达升高 |
| Lactococcus lactis IL1403 | 半乳糖代谢 | galK | 半乳糖激酶 | 催化 | 半乳糖诱导显著，酶活高达560-720 nmol/min·mg，葡萄糖下仅13-24 |
关键发现
- 在所有培养条件下L. lactis IL1403均维持同型乳酸发酵（>90%碳回收为乳酸），混合酸产物（甲酸、乙酸、乙醇）比例约2:1:1，但总量<10%。
- 在MS10R培养基上，半乳糖与葡萄糖的生长速率分别为0.17±0.01 h-1和0.55±0.06 h-1；糖消耗速率分别为7.1±0.1和17.8±1.1 mmol/g·h；在MCD培养基上对应生长速率为0.26±0.03和0.81±0.03 h-1，糖消耗速率为10.6±1.2和21.1±1.5 mmol/g·h。
- 添加离子载体莫能菌素（0.5 μM）不能提高糖消耗速率，表明分解代谢通量受限，结合低胞内代谢物浓度和高体外酶活性，推测糖转运为限速步骤。
- 胞内NADH/NAD比值约为0.08，且在不同条件下基本恒定。
- 甘油醛-3P脱氢酶对D-甘油醛-3P的Km为1 mM，对NAD为0.25 mM；丙酮酸激酶对ADP和PEP的Km分别为4 mM和1 mM；葡萄糖-6P异构酶在无机磷存在下对葡萄糖-6P的Km为5 mM（无磷时1.5 mM）；果糖-1,6P2醛缩酶对果糖-1,6P2的Km为9 mM（无磷时3 mM）。
- 三种脱氢酶（甘油醛-3P脱氢酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶）对NADH/NAD敏感，在体内比值0.08时其活性约为最大体外活性的50%。
- 转录组分析显示，葡萄糖下糖酵解基因（如fba、tpi、pyk、ldh）表达升高，而混合酸途径基因（如pta、ack、adhE）表达降低；pfl和ccpA在半乳糖下表达更高（部分培养基）。
- 翻译效率（k'）在葡萄糖培养细胞中平均比半乳糖培养细胞高3倍，说明存在糖依赖的翻译调控。
研究结论
乳酸乳球菌IL1403在不同糖源和培养基下均保持同型乳酸发酵，其分解代谢通量可能受糖转运步骤限制；糖酵解和混合酸途径基因的转录调控幅度较小（<3倍），但葡萄糖下的翻译效率显著高于半乳糖，这种转录-翻译的协同调控使得酶浓度得以维持；混合酸途径通量低可能与乙醇脱氢酶活性不足及丙酮酸甲酸裂解酶稳定性差有关。