高级醇 · 代谢工程文献库

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Identification of Escherichia coli ubiB, a Gene Required for the First Monooxygenase Step in Ubiquinone Biosynthesis

作者
WAYNE W. POON, DIANA E. DAVIS, HUAN T. HA, TANYA JONASSEN, PHILIP N. RATHER, CATHERINE F. CLARKE
单位
Department of Chemistry and Biochemistry and the Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, California 90095; Departments of Medicine and Molecular Biology and Microbiology, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, Ohio 44106
杂志
Journal of Bacteriology（2000）
DOI
10.1128/JB.182.18.5139-5146.2000
所属领域
代谢工程
关键词
Escherichia coliProvidencia stuartiiaarFcoenzyme QmonooxygenaseoctaprenylphenolubiBubiquinone
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解决的核心问题

鉴定大肠杆菌中泛醌（辅酶Q）生物合成所需的ubiB基因，并阐明其在第一个单加氧酶步骤中的作用，同时纠正先前将fre基因认定为ubiB的错误。

研究策略

利用Providencia stuartii中aarF基因的同源搜索，获得大肠杆菌yigR（即ubiB）基因；通过基因破坏突变体、脂质提取、HPLC和质谱分析中间产物，以及DNA片段互补实验，确定基因功能与遗传互作关系。

研究路线图

100%
研究问题：鉴定大肠杆菌泛醌合成所需ubiB基因
策略：同源搜索（P. stuartii aarF）获候选yigR基因
关键改造：构建基因破坏突变体（ubiB::Kan, aarF::Cm, fre::Kan）
关键改造：脂质提取+HPLC+质谱分析中间产物
关键改造：DNA片段互补实验+AN59突变位点鉴定
结果：ubiB和aarF突变体积累八异戊二烯酚，互补后恢复CoQ8合成
结果：AN59为ubiE中IS1插入极性突变，fre不参与CoQ合成
结论：ubiB编码首个单加氧酶步骤必需因子，谱系含ubiE-yigP-ubiB；UbiB为ABC1家族蛋白激酶，调控CoQ合成
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核心内容

该研究通过同源搜索和基因功能分析，鉴定了大肠杆菌中泛醌生物合成所必需的ubiB基因，并纠正了此前将fre基因误认为ubiB的错误。作者利用Providencia stuartii中aarF基因的序列信息，锁定大肠杆菌yigR基因即为ubiB，通过构建基因破坏突变体、脂质提取及HPLC和质谱分析中间产物，证实ubiB缺失株DM123积累八异戊二烯酚且无法合成辅酶Q8，互补实验则恢复其合成能力。研究还揭示原ubiB突变株AN59实际是ubiE基因中IS1插入导致的极性突变，使下游ubiB表达受阻，而fre基因破坏对CoQ8含量无显著影响，如L S1312中CoQ8含量为32.6 ng/mg干重，与野生型相当。DM123在稳定期仅产生48.7 ng/mg CoQ8，而野生型为184.0 ng/mg，表明UbiB功能对CoQ合成至关重要。该基因与酵母ABC1同源，可能编码蛋白激酶，通过磷酸化调控泛醌合成，且该过程在有氧/厌氧及不同生长阶段存在差异调节。

创新点

首次证明大肠杆菌yigR和P. stuartii aarF就是ubiB基因；揭示原ubiB突变株AN59实际是ubiE基因中IS1插入的极性突变；排除fre基因参与CoQ生物合成；提出UbiB可能为蛋白激酶并调控CoQ合成。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli 泛醌（辅酶Q）生物合成 ubiB (yigR) UbiB 调控 第一个单加氧酶步骤所需，可能为蛋白激酶，属于ABC1家族
Providencia stuartii 泛醌（辅酶Q）生物合成 aarF AarF 调控 与E. coli ubiB同源，突变导致CoQ缺乏并积累八异戊二烯酚
Escherichia coli 泛醌/甲基萘醌生物合成 ubiE UbiE 催化 C-甲基转移酶，AN59中因IS1插入而极性影响下游ubiB
Escherichia coli 泛醌生物合成 fre Fre 催化 NAD(P)H黄素氧化还原酶，经实验排除参与CoQ生物合成
Saccharomyces cerevisiae 泛醌生物合成 ABC1 Abc1 调控 UbiB同源蛋白的蛋白激酶家族原型成员，可能参与CoQ合成调控

关键发现

  1. L S1312（fre::Kan）中CoQ8含量为32.6±3.6 ng/mg干重，与野生型DH5α的40.3±6.2 ng/mg无显著差异
  2. DM123（ubiB::Kan）和PR54（aarF::Cm）均积累八异戊二烯酚（octaprenylphenol），并在互补后恢复CoQ8合成（质谱实测质量726.557122）
  3. AN59中鉴定出ubiE基因第516位插入IS1，导致极性效应使下游ubiB表达受阻
  4. AN59/pSK-2.6中仍积累八异戊二烯酚和DMK8
  5. DM123在稳定期可产生48.7±2.8 ng/mg的CoQ8，而野生型HW272为184.0±5.0 ng/mg
  6. fre基因破坏不影响CoQ合成。

研究结论

大肠杆菌ubiB（yigR）和P. stuartii aarF均为泛醌生物合成第一个单加氧酶步骤所必需的基因，它们属于一个包含ubiE、yigP、ubiB的操纵子。UbiB与酵母ABC1同源，可能具有蛋白激酶活性，通过磷酸化调节CoQ生物合成，且该过程在有氧/厌氧及指数期/稳定期存在差异调节。