Identification of a Lycopene β-Cyclase Required for Bacteriorhodopsin Biogenesis in the Archaeon Halobacterium salinarum
- 作者
- Ronald F. Peck, Eric A. Johnson, Mark P. Krebs
- 单位
- Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin Medical School; Department of Food Microbiology and Toxicology and Department of Bacteriology, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2002）
- DOI
- 10.1128/JB.184.11.2889-2897.2002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析盐沼盐杆菌（Halobacterium salinarum）中细菌视紫红质生物合成所需的番茄红素β-环化酶基因，阐明类胡萝卜素代谢产生视网膜辅因子的途径。
研究策略
基于基因组序列同源性搜索鉴定候选基因crtY；通过同源重组构建框内缺失突变株；结合类胡萝卜素与视网膜的HPLC定量分析和互补实验；在产番茄红素的大肠杆菌中异源表达验证酶功能。
核心内容
该研究在盐沼盐杆菌中鉴定并验证了番茄红素β-环化酶基因crtY，该酶是细菌视紫红质生物合成所必需的。研究者通过基因组同源性搜索锁定候选基因，利用同源重组构建框内缺失突变株，结合类胡萝卜素与视网膜的HPLC定量分析、互补实验及大肠杆菌异源表达验证其功能。结果显示，ΔcrtY菌株中细菌视紫红质、视网膜和β-胡萝卜素均无法检测，番茄红素积累至约1.3 nmol/mg总细胞蛋白；而互补菌株中三种产物均恢复至接近野生型水平。异源表达crtY的大肠杆菌成功产生β-胡萝卜素，MALDI-TOF质谱确认其m/z为536.42。值得注意的是，ΔcrtY菌株中细菌视紫红质脱辅基蛋白水平仅略有下降，表明BR缺失主要源于辅因子合成障碍而非蛋白表达受损。该研究首次在古菌中证实crtY编码功能性番茄红素β-环化酶，催化番茄红素转化为β-胡萝卜素并作为视网膜前体，为理解古菌类胡萝卜素代谢与视紫红质生物合成途径的进化关系提供了新见解。
创新点
首次在古菌中鉴定了参与细菌视紫红质生物合成的番茄红素β-环化酶基因crtY；通过基因缺失和异源互补证实其功能；提出了该酶在进化上介于细菌异源二聚体与真菌双功能酶之间的中间拓扑模型。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Halobacterium salinarum | 类胡萝卜素生物合成 / 细菌视紫红质生物合成 | crtY | CrtY | 催化 | 番茄红素β-环化酶，催化番茄红素转化为β-胡萝卜素，为视网膜合成提供前体 |
| Halobacterium salinarum | 类胡萝卜素生物合成 | brp | Brp | 催化 | 此前发现的基因，与blh一同推测参与β-胡萝卜素氧化裂解为视网膜 |
| Halobacterium salinarum | 类胡萝卜素生物合成 | blh | Blh | 催化 | brp的旁系同源基因，推测与brp冗余参与β-胡萝卜素向视网膜的转化 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY（来自Halobacterium salinarum） | CrtY | 催化 | 异源表达于产番茄红素的大肠杆菌中，证实其催化β-胡萝卜素生成 |
关键发现
- 在ΔcrtY菌株中，细菌视紫红质（BR）、视网膜和β-胡萝卜素均无法检测，而番茄红素积累至约1.3 nmol/mg总细胞蛋白
- 野生型BR约占细胞总蛋白的4%。互补菌株中BR、β-胡萝卜素和视网膜恢复至接近野生型水平，番茄红素消失。异源表达H. salinarum crtY的大肠杆菌产生β-胡萝卜素，MALDI-TOF质谱鉴定其m/z为536.42，与β-胡萝卜素标准品一致。ΔcrtY菌株中细菌视紫红质脱辅基蛋白（BO）水平仅略有下降，说明BR缺失主要源于辅因子合成障碍。
研究结论
crtY编码功能性番茄红素β-环化酶，该酶是H. salinarum中细菌视紫红质生物合成所必需的，催化番茄红素转化为β-胡萝卜素，进而作为视网膜合成的前体。