Synthesis and Posttranslational Regulation of Pyruvate Formate-Lyase in Lactococcus lactis
- 作者
- Claus Rix Melchiorsen, Kirsten Væver Jokumsen, John Villadsen, Mads G. Johnsen, Hans Israelsen, José Arnau
- 单位
- Department of Biotechnology, Center for Process Biotechnology, Technical University of Denmark, DK-2800 Lyngby, Denmark; Biotechnological Institute, DK-2970 Hørsholm, Denmark
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2000）
- DOI
- 10.1128/JB.182.17.4783-4788.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析乳酸乳球菌中丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的合成与翻译后调控机制，尤其是氧对PFL活性的影响以及不同生长条件下PFL蛋白水平与活性的调控关系。
研究策略
在大肠杆菌中重组表达并纯化乳酸乳球菌PFL，制备特异性抗体；利用Western blotting和ELISA检测不同碳源（葡萄糖/半乳糖）和通气条件（有氧/厌氧）下PFL蛋白水平及活性形式，并结合代谢产物分析（HPLC）进行比较。
核心内容
该研究以乳酸乳球菌MG1363为对象，系统解析了丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）的合成与翻译后调控机制。作者在大肠杆菌中重组表达并纯化His标记的PFL，制备特异性抗体，并通过Western blotting和ELISA定量检测不同碳源及通气条件下PFL蛋白水平与活性形式，结合HPLC分析代谢产物。结果显示，在MS10培养基中厌氧生长于半乳糖时，PFL蛋白水平约为葡萄糖条件下的5倍（ELISA检测值7.3 vs 1.5）；有氧条件下虽无甲酸生成但仍可检测到PFL蛋白，且主要以未切割的非活性形式存在；短时间暴露于空气即可导致PFL部分切割，证实其氧敏感性。代谢分析表明，厌氧半乳糖生长时甲酸产量达0.64 mol/mol糖，混合酸产物占33%碳流，显著高于葡萄糖条件。此外，adhE突变株不影响PFL的氧保护，说明乳酸乳球菌的调控机制与大肠杆菌不同，ADHE不参与该过程。这些结果揭示了PFL蛋白水平随生长条件动态变化，并与代谢模式从同型乳酸发酵向混合酸发酵转换相关联，为乳酸菌代谢工程改造提供了调控层面的新认识。
创新点
开发了免疫化学方法（Western blot和ELISA）用于定量检测乳酸乳球菌PFL蛋白水平并区分活性与非活性形式；首次发现乳酸乳球菌PFL蛋白水平受碳源和氧的显著调控；证明乳酸乳球菌ADHE不参与PFL的氧保护，与大肠杆菌机制不同。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactococcus lactis MG1363 | 丙酮酸代谢（混合酸发酵） | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶（PFL） | 催化 | 催化丙酮酸和CoA转化为甲酸和乙酰CoA，是混合酸发酵的起始步骤；其活性受氧和翻译后修饰调控。 |
| Lactococcus lactis MG1363 | 混合酸发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶（ADHE） | 调控 | 在乳酸乳球菌中检测其是否具有PFL去激活酶活性，结果表明不参与PFL的氧保护，与大肠杆菌相反。 |
| Escherichia coli M15 | 重组蛋白表达 | pfl | His标记的PFL（His-PFL） | 催化 | 用于重组表达和纯化乳酸乳球菌PFL，制备特异性多克隆抗体。 |
关键发现
- 在MS10培养基中，厌氧生长于半乳糖时PFL蛋白水平是葡萄糖的5倍（7.3 vs 1.5，ELISA）
- 有氧条件下虽无甲酸生成但仍检测到PFL蛋白
- 厌氧生长时PFL被完全激活，有氧复杂培养基中PFL主要以未切割的非活性形式存在
- 暴露于空气5分钟导致PFL部分切割，证实氧敏感性
- adhE突变株不影响PFL的氧保护
- 厌氧葡萄糖生长时乳酸产量1.85 mol/mol糖，甲酸0.05
- 厌氧半乳糖生长时乳酸1.39，甲酸0.64，混合酸产物占33%碳流。
研究结论
乳酸乳球菌中PFL的蛋白水平受生长条件调控，半乳糖厌氧生长时PFL水平显著升高，与代谢从同型乳酸发酵转向混合酸发酵相关；PFL的翻译后激活/失活调控因生长条件而异，且其机制与大肠杆菌不同，ADHE不参与氧保护。