Eubacterial Diterpene Cyclase Genes Essential for Production of the Isoprenoid Antibiotic Terpentecin
- 作者
- TOHRU DAIRI, YOSHIMITSU HAMANO, TOMOHISA KUZUYAMA, NOBUYA ITOH, KAZUO FURIHATA, HARUO SETO
- 单位
- Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University; Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo; Division of Agriculture and Agricultural Life Science, The University of Tokyo
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.20.6085-6094.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
真细菌中是否存在二萜环化酶（DC）？本研究旨在鉴定产萜类抗生素terpentecin的链霉菌中负责二萜骨架形成的环化酶基因，并证明其功能。
研究策略
对terpentecin产生菌Streptomyces griseoloporesus MF730-N6中甲羟戊酸途径基因簇上游区域进行测序，发现ORF11和ORF12两个推定环化酶基因；通过基因中断和互补实验验证其必需性；在变铅青链霉菌中异源表达并分离产物；在大肠杆菌中过表达纯化两个酶，体外验证催化GGDP生成terpentetriene。
核心内容
本研究对产萜类抗生素terpentecin的链霉菌Streptomyces griseoloporesus MF730-N6中甲羟戊酸途径基因簇上游区域进行测序，鉴定出ORF11和ORF12两个推定环化酶基因。基因中断实验显示，任一基因的缺失均使突变株完全丧失terpentecin产生能力，互补后恢复，证明二者为生物合成所必需。在变铅青链霉菌中异源表达两基因产生新化合物terpentetriene，高分辨质谱实测M+ 272.2547，与C20H32理论值吻合。在大肠杆菌中过表达并纯化两个His标签蛋白（分子量分别约55 kDa和37 kDa），体外实验证实二者共同催化GGDP经两步环化生成terpentetriene。序列分析显示ORF11与真核二萜环化酶同源，含ORPDGLW和DGDDTA基序，与真菌ent-kaurene synthase一致性达29%；ORF12含DDXXD基序，与原核pentalenene synthase一致性25%。此为首次报道真细菌来源的二萜环化酶基因，证实了真细菌中该类酶的存在，为terpentecin生物合成途径阐明和萜类天然产物异源生产奠定了基础。
创新点
首次报道真细菌来源的二萜环化酶基因；揭示双环化酶协同催化GGDP环化生成新型二萜terpentetriene（ent-clerod-3,13(16),14-三烯的C-8立体异构体）。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces griseoloporesus MF730-N6 | terpentecin生物合成/二萜生物合成 | ORF11 | 二萜环化酶（类似真核DC的N端结构域） | 催化 | 推定通过质子化引发GGDP环化，形成phosphodiester中间体 |
| Streptomyces griseoloporesus MF730-N6 | terpentecin生物合成/二萜生物合成 | ORF12 | 二萜环化酶（类似pentalenene synthase） | 催化 | 推定通过电离依赖的环化完成反应，与ORF11共同生成terpentetriene |
| Streptomyces lividans TK23 | 异源表达的二萜生物合成 | ORF11和ORF12 | 二萜环化酶ORF11和ORF12 | 催化 | 在ermE*启动子控制下与GGDP合酶共表达，产生terpentetriene |
| Escherichia coli M15/pREP4 | 体外酶促反应 | ORF11和ORF12 | His标签融合的二萜环化酶ORF11和ORF12 | 催化 | 纯化蛋白催化GGDP生成terpentetriene，单独任一蛋白无活性 |
关键发现
- ORF11和ORF12基因中断突变株完全丧失terpentecin（TP）产生能力，互补后恢复
- 异源表达产生新化合物terpentetriene，分子式为C20H32，高分辨质谱实测M+ 272.2547（计算值272.2504）
- 纯化的ORF11和ORF12蛋白（His标签，分子量分别约55 kDa和37 kDa）共同催化GGDP生成terpentetriene
- ORF11与真核DC同源，具有QXXDGSW和DXDDTA基序（实际序列为ORPDGLW和DGDDTA），与真菌ent-kaurene synthase一致性29%（494 aa）
- ORF12与原核pentalenene synthase一致性25%（331 aa），具有DDXXD基序（DDRWD）。Northern blot显示ORF10-ORF14可能共转录，6.5 kb转录本。
研究结论
ORF11和ORF12编码真细菌来源的二萜环化酶，共同催化GGDP经两步环化反应生成terpentetriene，这是terpentecin生物合成的关键步骤；该研究首次证明真细菌中存在二萜环化酶。