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Cloning and Characterization of 1-Deoxy-d-Xylulose 5-Phosphate Synthase from Streptomyces sp. Strain CL190, Which Uses both the Mevalonate and Nonmevalonate Pathways for Isopentenyl Diphosphate Biosynthesis

作者
Tomohisa Kuzuyama, Motoki Takagi, Shunji Takahashi, Haruo Seto
单位
Institute of Molecular and Cellular Biosciences, University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0032, Japan
杂志
Journal of Bacteriology（2000）
DOI
10.1128/JB.182.4.891-897.2000
所属领域
代谢工程
关键词
1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthaseStreptomycesisopentenyl diphosphatemevalonate pathwaynonmevalonate pathway
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解决的核心问题

克隆并表征同时具有甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径的链霉菌CL190中的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXP合酶），以阐明其在非甲羟戊酸途径中的作用及酶学性质，并为理解该途径的限速步骤提供动力学参数。

研究策略

基于DXP合酶同源物中保守氨基酸序列设计PCR引物，从CL190基因组中扩增dxs基因；将基因克隆至表达载体pQE30，在大肠杆菌中过表达并纯化重组酶；测定其分子量、pH/温度依赖性、金属离子需求及动力学参数，并与大肠杆菌DXP合酶进行比较。

研究路线图

100%
核心问题：CL190中DXP合酶功能待阐明
策略：设计引物克隆dxs基因
关键改造：pQE30载体过表达重组酶
生化表征：分子量·活性·动力学
结果：酶学性质与大肠杆菌对比
结论：限速酶·抗菌药靶点
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核心内容

本研究从同时具备甲羟戊酸与非甲羟戊酸两条异戊烯焦磷酸生物合成途径的链霉菌Streptomyces sp. CL190中克隆了编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXP合酶）的dxs基因，并在大肠杆菌中实现了重组表达与纯化。该基因编码631个氨基酸，预测分子量为68 kDa，而重组酶在SDS-PAGE中显示70 kDa条带，凝胶过滤测得分子量约130 kDa，表明其以二聚体形式存在。酶学表征显示，该酶催化丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合生成DXP，绝对依赖硫胺素二磷酸，最适pH为9.0，最适温度42–44°C。动力学参数方面，对丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸的Km值分别为65 μM和120 μM，Vmax为370 U/mg；对D-甘油醛的亲和力远低，Km达35 mM，较D-甘油醛3-磷酸低约290倍。酶活性需要Mg2+或Mn2+，1 mM浓度最佳，EDTA可完全抑制。与大肠杆菌DXP合酶相比，两者酶学性质相似，仅pH最适值存在差异。这些结果表明该酶可能为非甲羟戊酸途径的限速酶，其特异性抑制剂有望发展为对人低毒的抗菌药或除草剂。

创新点

首次从同时利用甲羟戊酸和非甲羟戊酸途径的链霉菌中克隆DXP合酶基因；对重组酶进行了详细的生化表征，包括底物特异性、动力学常数和二聚体结构；纯化并比较了CL190与大肠杆菌DXP合酶的酶学性质，发现两者在pH最适值上存在差异。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Streptomyces sp. strain CL190 非甲羟戊酸途径 (DXP途径) dxs 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 催化 从CL190基因组克隆dxs基因，编码631个氨基酸的DXP合酶
Escherichia coli 非甲羟戊酸途径 dxs 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 催化 作为异源表达宿主，用于过表达和纯化CL190 DXP合酶，并用于酶学性质比较

关键发现

  1. 克隆的dxs基因编码631个氨基酸，预测分子量68 kDa
  2. 重组酶SDS-PAGE表观分子量为70 kDa，凝胶过滤分子量约130 kDa，表明其为二聚体
  3. 酶催化丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合生成DXP，绝对依赖硫胺素二磷酸
  4. pH最适值为9.0，最适温度为42-44°C，活化能99 kJ/mol
  5. Km值：丙酮酸65 μM，D-甘油醛3-磷酸120 μM，Vmax为370 U/mg
  6. 对D-甘油醛的Km为35 mM，比D-甘油醛3-磷酸高约290倍
  7. 需要Mg2+或Mn2+，1 mM最佳，EDTA完全抑制活性
  8. 大肠杆菌DXP合酶性质相似，仅pH最适值为7.5-8.0。

研究结论

成功克隆并表征了Streptomyces sp. CL190的DXP合酶，其与大肠杆菌DXP合酶具有相似的酶学特性；该酶可能作为非甲羟戊酸途径的限速酶，其特异性抑制剂有望成为对人类无毒的抗菌药或除草剂。