Engineering a Homo-Ethanol Pathway in Escherichia coli: Increased Glycolytic Flux and Levels of Expression of Glycolytic Genes during Xylose Fermentation
- 作者
- HAN TAO, RAMON GONZALEZ, ALFREDO MARTINEZ, MARIA RODRIGUEZ, L. O. INGRAM, J. F. PRESTON, K. T. SHANMUGAM
- 单位
- Institute of Food and Agricultural Sciences, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida, Gainesville, Florida 32611
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.10.2979-2988.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析工程菌E. coli KO11在木糖厌氧发酵中生长速率和糖酵解通量显著高于亲本菌株B的分子机制，探究引入同型乙醇途径对木糖分解代谢基因表达的影响。
研究策略
将Zymomonas mobilis的pdc和adhB基因整合到大肠杆菌B中构建KO11，通过基因芯片技术比较两菌株在木糖发酵过程中涉及木糖分解为丙酮酸的30个基因的表达水平，并测定生长、发酵产物和关键酶活性，结合统计分析验证差异表达。
核心内容
本研究将运动发酵单胞菌的pdc和adhB基因整合至大肠杆菌B基因组中，构建了同型乙醇工程菌KO11，并利用全基因组基因芯片系统比较了KO11与亲本菌株B在木糖厌氧发酵过程中30个木糖分解相关基因的转录水平差异。结果显示，KO11的最大比生长速率为0.224/h，约为亲本B的1.3倍；最大糖酵解通量达0.278 μmol xylose/min/mg蛋白，约为B的1.5倍；平均木糖利用速率为2 g/L/h，而B仅为0.6 g/L/h。在发酵活跃期，KO11中14个基因（涵盖木糖转运、异构化、磷酸化、戊糖磷酸途径及糖酵解等多个环节）表达显著上调1.5至8倍，其中xylA和xylB的mRNA水平与其酶活性增幅（分别高约2.9倍和2.0倍）高度一致。这些结果表明，引入同型乙醇途径通过某种协调机制普遍上调了木糖代谢基因的表达，为KO11更高的生长速率和糖酵解通量提供了分子基础。
创新点
首次采用全基因组基因阵列技术分析代谢工程菌株的全局转录变化，将糖酵解通量的增加与木糖分解基因的整体上调联系起来；确认了xylA和xylB的mRNA水平与酶活性变化的一致性。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 木糖分解代谢 | xylA | 木糖异构酶 | 催化 | KO11中表达水平平均为B的3.1倍，活性平均为2.9倍 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 木糖分解代谢 | xylB | 木酮糖激酶 | 催化 | KO11中表达水平平均为B的2.1倍，活性平均为2.0倍 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 木糖转运 | xylE | 木糖/H+同向转运体 | 转运 | 属于xylR调控的xylE操纵子，KO11中表达显著上调 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 木糖转运 | xylF, xylG, xylH | 木糖ABC转运系统 | 转运 | xylFGH操纵子，KO11中xylF和xylG表达显著上调，xylH未显著 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 木糖分解代谢调控 | xylR | XylR转录调控蛋白 | 调控 | 正向调控xylAB和xylFGH操纵子，KO11中表达上调 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 戊糖磷酸途径 | rpiA, rpiB | 核糖-5-磷酸异构酶 | 催化 | KO11中两者表达均显著高于B |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 戊糖磷酸途径 | talA, talB | 转醛醇酶 | 催化 | KO11中talB表达上调，但talA在单时间点高于B |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 戊糖磷酸途径 | tktA, tktB | 转酮醇酶 | 催化 | tktA表达极高，约占总cDNA的1%，两菌株间无显著差异 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | pfkA, pfkB | 磷酸果糖激酶 | 催化 | KO11中pfkA显著上调，pfkB无显著差异 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | fbaA, fbaB | 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 | 催化 | KO11中fbaA显著上调，fbaB在单时间点高于B |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | tpiA | 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | KO11中显著上调 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | gapA, gapC_1, gapC_2 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | KO11中gapA显著上调，gapC表达低且不确定 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | pgk | 磷酸甘油酸激酶 | 催化 | KO11中显著上调 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | eno | 烯醇化酶 | 催化 | 在单时间点B表达高于KO11 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | pykA, pykF | 丙酮酸激酶 | 催化 | KO11中pykF显著上调，pykA表达无显著差异但趋势一致 |
| Escherichia coli B (ATCC 11303) | 糖酵解 | gpmA, gpmB, yibO | 磷酸甘油酸变位酶 | 催化 | gpmA在K11中不高，yibO表达随发酵时间增加 |
| Escherichia coli KO11 | 同型乙醇发酵 | pdc (Zymomonas mobilis) | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 从Zymomonas mobilis整合，使丙酮酸转向乙醇 |
| Escherichia coli KO11 | 同型乙醇发酵 | adhB (Zymomonas mobilis) | 乙醇脱氢酶II | 催化 | 与pdc共同实现乙醇发酵，NADH再生 |
关键发现
- KO11最大比生长速率为0.224/h，约为亲本B的1.3倍
- 最大糖酵解通量为0.278 μmol xylose/min/mg蛋白，约为B的1.5倍
- 平均木糖利用速率KO11为2 g/L/h，B仅0.6 g/L/h
- 在活跃发酵期(6,12,24h)，有14个木糖代谢相关基因（xyLAB, xyIE, xyIFG, xyIR, rpiA, rpiB, pfkA, fbaA, tpiA, gapA, pgk, pykA）表达水平在KO11中显著上调（P<0.05），幅度达1.5-8倍
- 木糖异构酶(xylA)活性在KO11中平均高2.9倍，木酮糖激酶(xylB)活性平均高2.0倍
- mRNA比率与酶活性比率基本一致。
研究结论
KO11中木糖分解代谢相关基因表达水平的普遍升高为其更高的生长速率和糖酵解通量提供了生理基础，代谢工程改造导致的乙醇发酵途径可能通过某种协调机制上调了木糖代谢基因的表达。