Isoprenoid Biosynthesis in Synechocystis sp. Strain PCC6803 Is Stimulated by Compounds of the Pentose Phosphate Cycle but Not by Pyruvate or Deoxyxylulose-5-Phosphate
- 作者
- Yuri V. Ershov, R. Raymond Gantt, Francis X. Cunningham, Jr., Elisabeth Gantt
- 单位
- Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland, College Park, Maryland 20742
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2002）
- DOI
- 10.1128/JB.184.18.5045-5051.2002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究光合蓝藻 Synechocystis sp. PCC6803 在光合条件下类异戊二烯生物合成是否遵循大肠杆菌中定义的 MEP 途径，以及丙酮酸和脱氧木酮糖-5-磷酸等初始底物是否参与该过程。
研究策略
利用集胞藻 PCC6803 的无细胞提取物（60000×g 上清），以 [14C]IPP 掺入异戊二烯类化合物的量作为指标，分别添加丙酮酸、DXP、磷酸戊糖循环中间代谢物及相关酶，并测试 MEP 途径特异性抑制剂 fosmidomycin 对光合生长和体外掺入的影响。
核心内容
该研究以集胞藻PCC6803无细胞提取物为体系，通过[14C]IPP掺入实验系统考察了光合条件下类异戊二烯生物合成的底物偏好。结果显示，1 mM甘油醛-3-磷酸或500 μM磷酸二羟丙酮单独添加即可显著刺激异戊二烯合成，二者联合效果更强，且至少70%的放射性标记出现在法尼醇和香叶基香叶醇中；相反，MEP途径的初始底物丙酮酸和脱氧木酮糖-5-磷酸（各500 μM）无显著刺激作用。磷酸戊糖循环中间物中，6-磷酸葡萄糖酸和6-磷酸果糖效果最强，添加核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶可使核酮糖-5-磷酸的刺激作用加倍。此外，MEP途径特异性抑制剂fosmidomycin在1 mM浓度下对集胞藻光合生长及体外掺入均无抑制，而该浓度远高于完全抑制大肠杆菌所需的0.5–1.0 μM。这些结果提示，在光合自养条件下，集胞藻PCC6803的类异戊二烯合成并非依赖经典MEP途径，光合作用产生的磷酸戊糖循环中间代谢物可能是异戊烯基焦磷酸更直接的前体来源，且该菌缺乏I型异戊烯基焦磷酸异构酶活性，支持存在从光合代谢物直接合成二甲基烯丙基焦磷酸的替代分支。
创新点
首次在集胞藻 PCC6803 中证明光合条件下磷酸戊糖循环化合物（如 DHAP、GA3P、GL6P、FR6P 等）能显著刺激异戊二烯合成，而 MEP 途径的初始底物丙酮酸和 DXP 无刺激作用；fosmidomycin 在高达 1 mM 浓度下对集胞藻光合生长无抑制，提示该菌中 MEP 途径并非主要合成途径，可能存在替代的 DMAPP 合成分支。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC6803 | MEP pathway (非甲羟戊酸途径) | dxs | DXP synthase (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase) | 催化 | 催化丙酮酸和 GA3P 缩合生成 DXP；在本研究中添加丙酮酸和 DXP 均未刺激异戊二烯合成，提示该反应在光合条件下可能非主要入口 |
| Synechocystis sp. PCC6803 | MEP pathway | dxr | DXP reductoisomerase (DXR) | 催化 | fosmidomycin 的靶点；fosmidomycin 在 1 μM 和 1 mM 下均不抑制集胞藻光合生长，且不影响体外 [14C]IPP 掺入，提示该酶在光合条件下可能非必需 |
| Synechocystis sp. PCC6803 | MEP pathway | lytB (ispH) | LytB | 催化 | 被认为是 MEP 途径通向 IPP 和 DMAPP 分支点的关键酶，本研究中提及但未直接测定其活性 |
| Synechocystis sp. PCC6803 | 类异戊二烯生物合成 | ipi (缺失) | IPP isomerase (type I) | 催化 | 在集胞藻基因组中不存在 ipi 基因；本研究中用常规方法及含 NADPH/FAD 的条件均未检测到 IPP 异构酶活性 |
| Synechocystis sp. PCC6803 | 类异戊二烯生物合成 | type II IPP isomerase 同源基因 | Type II IPP isomerase | 催化 | 基因组中存在与 Streptomyces sp. CL190 型 II 异构酶相似的同源序列，但未检测到活性；其功能尚待验证 |
关键发现
- 体外无细胞体系中，1 mM GA3P 或 500 μM DHAP 单独添加均可显著刺激 [14C]IPP 掺入，GA3P 与 DHAP 联合刺激效果更强
- 至少 70% 的 14C 标记出现在法尼醇 (C15) 和香叶基香叶醇 (C20)。丙酮酸和 DXP（各 500 μM）无显著刺激作用。磷酸戊糖循环化合物中，GL6P 和 FR6P 效果最强，其次为 ER4P 和 6PG
- MEP（500 μM）有刺激作用但弱于多种磷酸糖。添加 RUSP-3-表异构酶使 RUSP 的刺激作用加倍，再加 GA3P 进一步增强约 50%
- 6PG 与 GA3P 联合再加入 6PG-脱氢酶和 RUSP-3-表异构酶后刺激作用增强约 30%。fosmidomycin 在 1 μM 和 1 mM 浓度下对集胞藻光合生长无明显抑制（0.5–1.0 μM 可完全抑制大肠杆菌生长），且不影响 DHAP+GA3P 刺激的 [14C]IPP 掺入。
研究结论
在光合自养条件下，集胞藻 PCC6803 中类异戊二烯生物合成的主要途径并非大肠杆菌定义的 MEP 途径；光合作用产生的磷酸戊糖循环中间产物可能是 DMAPP 合成的前体来源。IPP 异构酶活性缺乏，支持存在从光合代谢物直接合成 DMAPP 的替代路径。