Genetic Manipulation of Carotenoid Biosynthesis in the Green Sulfur Bacterium Chlorobium tepidum
- 作者
- Niels-Ulrik Frigaard, Julia A. Maresca, Colleen E. Yunker, A. Daniel Jones, Donald A. Bryant
- 单位
- Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University; Department of Chemistry, The Pennsylvania State University
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2004）
- DOI
- 10.1128/JB.186.16.5210-5220.2004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定绿色硫细菌Chlorobium tepidum中类胡萝卜素生物合成相关基因，并阐明类胡萝卜素的生物合成途径及其生理功能。
研究策略
基于基因组序列分析，利用自然转化和同源重组构建9个候选基因的插入失活突变体，通过HPLC-MS分析突变体色素组成，结合生长速率测定和系统发育分析，揭示类胡萝卜素生物合成途径和相关酶的功能。
核心内容
该研究通过基因组序列分析与自然转化同源重组技术，在绿色硫细菌Chlorobium tepidum中构建了9个候选基因的插入失活突变体，结合HPLC-MS色素组成分析和生长速率测定，系统解析了类胡萝卜素生物合成途径。研究鉴定出6个功能基因：crtB编码八氢番茄红素合酶、crtP和crtQ分别编码八氢番茄红素和ζ-胡萝卜素脱饱和酶、crtU编码γ-胡萝卜素脱饱和酶、crtC编码水合酶、crtH编码顺反异构酶，并确认该途径采用植物/蓝藻型的CrtP/CrtQ/CrtH酶系统而非细菌常见的CrtI型。各突变体分别累积相应前体，其中crtB突变体完全缺乏类胡萝卜素，crtP突变体八氢番茄红素含量达81 mg/g BChl c。完全缺乏类胡萝卜素的crtB突变体仍可光合生长，表明类胡萝卜素并非光合作用必需，但有色类胡萝卜素缺失导致BChl a含量降至野生型的约65%，且在低光强下生长速率降至野生型的25%。这些结果揭示了类胡萝卜素在维持光合色素水平和正常生长中的结构及光保护功能，为理解绿色硫细菌的光合适应机制提供了重要依据。
创新点
首次系统解析了绿色硫细菌的类胡萝卜素生物合成途径；发现该途径利用植物/蓝藻型的CrtP/CrtQ/CrtH酶而非细菌常见的CrtI；通过构建完全缺乏类胡萝卜素的crtB突变体证明类胡萝卜素并非绿色硫细菌光合生长所必需；发现有色类胡萝卜素缺失导致BChl a含量降低和生长缺陷。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | crtB (CT1386) | 八氢番茄红素合酶 (Phytoene synthase) | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素；敲除后完全无类胡萝卜素 |
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | crtP (CT0807) | 八氢番茄红素脱饱和酶 (Phytoene desaturase) | 催化 | 催化八氢番茄红素脱饱和生成ζ-胡萝卜素；敲除后积累八氢番茄红素 |
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | crtQ (CT1414) | ζ-胡萝卜素脱饱和酶 (ζ-carotene desaturase) | 催化 | 催化ζ-胡萝卜素脱饱和生成番茄红素；敲除后积累ζ-胡萝卜素 |
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | crtU (CT0323) | γ-胡萝卜素脱饱和酶 (γ-carotene desaturase) | 催化 | 催化γ-胡萝卜素脱饱和生成氯菌烯；敲除后仅积累γ-胡萝卜素及其衍生物 |
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | crtC (CT0301) | 类胡萝卜素1',2'-水合酶 (Carotenoid 1',2'-hydratase) | 催化 | 催化γ-胡萝卜素和氯菌烯的水合；敲除后缺乏OH-类胡萝卜素及其衍生物 |
| Chlorobium tepidum | 类胡萝卜素生物合成 | crtH (CT0649) | 类胡萝卜素顺反异构酶 (Carotenoid cis-trans isomerase) | 催化 | 催化顺式番茄红素异构化为全反式番茄红素；敲除后积累番茄红素 |
关键发现
- 通过基因失活鉴定出6个类胡萝卜素合成基因：crtB（CT1386，八氢番茄红素合酶）、crtP（CT0807，八氢番茄红素脱饱和酶）、crtQ（CT1414，ζ-胡萝卜素脱饱和酶）、crtU（CT0323，γ-胡萝卜素脱饱和酶）、crtC（CT0301，类胡萝卜素1',2'-水合酶）、crtH（CT0649，类胡萝卜素顺反异构酶）。CT1386敲除菌株完全缺乏类胡萝卜素
- CT0807菌株积累八氢番茄红素（81 mg/g BChl c）
- CT1414菌株积累ζ-胡萝卜素（48 mg/g BChl c）
- CT0649菌株积累番茄红素（21 mg/g BChl c）
- CT0323菌株积累γ-胡萝卜素（41 mg/g BChl c）且无氯菌烯。crtB、crtP、crtQ突变体的BChl a含量约为野生型的65%（野生型19 mg/g BChl c，突变体11-13 mg/g BChl c）。在10 μmol photons m-2 s-1光强下，crtP和crtQ突变体生长速率约为野生型的40%，crtB突变体约为25%
- 在588 μmol photons m-2 s-1下，三者约为野生型的65%。添加3 μM MPTA时番茄红素占总类胡萝卜素的80%，100 μM时占90%。
研究结论
C. tepidum的类胡萝卜素生物合成途径与蓝藻和植物相似，采用CrtP/CrtQ/CrtH型脱饱和与异构化；类胡萝卜素不是光合生长必需的，但有色类胡萝卜素对维持BChl a水平和正常生长速率具有重要作用，可能具有结构和光保护功能。