The Reaction Center H Subunit Is Not Required for High Levels of Light-Harvesting Complex 1 in Rhodospirillum rubrum Mutants
- 作者
- Domenico Lupo, Robin Ghosh
- 单位
- Department of Bioenergetics, Institute of Biology, University of Stuttgart, Stuttgart, Germany
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2004）
- DOI
- 10.1128/JB.186.17.5585-5595.2004
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
反应中心 H 亚基（puhA 编码）是否对光合细菌 Rhodospirillum rubrum 中 LH1 复合物的高水平形成及光合膜的形成是必需的？
研究策略
通过定点插入诱变精确删除 puhA 基因，使用不含转录终止子的卡那霉素抗性盒以避免极性效应，在野生型 S1 和无类胡萝卜素 G9 菌株中分别构建突变体，并在不同培养基（M、M2S、M2SF）中培养，利用吸收光谱、近红外圆二色谱、SDS-PAGE、ESR 和电子显微镜等检测 LH1、RC 和光合膜的表型。
核心内容
该研究通过定点插入诱变在Rhodospirillum rubrum野生型S1和无类胡萝卜素G9菌株中精确删除反应中心H亚基编码基因puhA，并使用无极性卡那霉素抗性盒避免对侧翼基因的影响。在不同培养基条件下检测突变体的LH1复合物水平和光合膜形成。结果显示，在M2SF培养基中SPUHK1、SPUHK2、GPUHK1和GPUHK2的LH1分别达到野生型的83%、103%、69%和89%，但在M培养基中无类胡萝卜素的G9突变体完全检测不到LH1峰。所有突变体均无法进行光合生长，但半好氧生长正常，且光诱导ESR信号缺失。电子显微镜显示突变体在M2SF中可形成与野生型相似的光合膜。互补实验证实携带完整puh操纵子的质粒可恢复光养生长。这些结果表明H亚基对LH1复合物的高水平形成并非必需，但对功能性反应中心的组装至关重要，同时类胡萝卜素在缺乏H亚基时对稳定LH1起关键作用。
创新点
['精确删除 puhA 而不影响侧翼基因（如 G115/lhaA）的开放阅读框', '使用无极性卡那霉素盒排除了极性效应', '首次采用 M2SF 培养基（含琥珀酸和果糖）测试光合基因突变体的表型', '首次报道类胡萝卜素在 puhA 缺失时对 LH1 形成的稳定作用', '证明 H 亚基对于 LH1 的完全组装并非必需']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodospirillum rubrum S1 | 光合作用 puh 操纵子 | puhA | 反应中心 H 亚基 | 调控 | 编码 RC H 亚基，其缺失不影响 LH1 高水平形成，但导致 RC 组装完全缺失，突变体无法光合生长 |
| Rhodospirillum rubrum G9 | 光合作用 puh 操纵子 | puhA | 反应中心 H 亚基 | 调控 | 无类胡萝卜素菌株，puhA 缺失在 M 培养基中导致 LH1 完全消失，在 M2SF 中恢复至野生型的 69-89% |
| Rhodospirillum rubrum S1 | 光合作用 puh 操纵子 | G115 | LhaA 同源物 | 调控 | 位于 puhA 上游，可能参与 LH1 组装增强，与 Rhodobacter capsulatus 的 lhaA 同源 |
| Rhodospirillum rubrum S1 | LH1 合成 | — | LH1 复合物（αβ 二聚体） | 能量供给 | 捕光复合物 1，负责光能吸收和传递，其组装在 puhA 缺失时仍可达到野生型水平，受类胡萝卜素稳定 |
关键发现
- 在 M 培养基中，S1 来源的 puhA 缺失突变体（SPUHK1、SPUHK2）LH1 吸收峰为野生型的 93% 和 71%；在 M2S 培养基中，S1 和 G9 突变体 LH1 水平分别降至野生型的 32-38% 和 26-32%；在 M2SF 培养基中，SPUHK1、SPUHK2、GPUHK1、GPUHK2 的 LH1 分别达到野生型的 83%、103%、69% 和 89%。无类胡萝卜素的 G9 突变体在 M 培养基中完全检测不到 LH1 峰。生化测定显示 SPUHK1 和 SPUHK2 的 BChl 含量分别为
- 66±16 和
- 25±7.22 nmol/mg 蛋白，对应野生型的 99% 和 71%。所有突变体无法进行光合生长，但半好氧生长正常；RC 的 760 nm 和 802 nm 吸收峰及光诱导 ESR 信号均缺失。电子显微镜显示在 M2SF 中突变体形成与野生型相似的光合膜。互补实验表明，携带完整 puh 操纵子的质粒（pRKOPUH1）可恢复光养生长，且 LH1 水平达到野生型的 70-90%。这些结果证明 H 亚基对 LH1 高水平形成非必需，而类胡萝卜素对 LH1 有稳定作用。
研究结论
反应中心 H 亚基（puhA）对于 Rhodospirillum rubrum 中 LH1 复合物的最大形成和光合膜的形成不是必需的，但对功能性 RC 的组装至关重要；类胡萝卜素在缺乏 H 亚基时对稳定 LH1 起重要作用。