Functional Analysis of All Aminotransferase Proteins Inferred from the Genome Sequence of Corynebacterium glutamicum
- 作者
- Jan Marienhagen, Nicole Kennerknecht, Hermann Sahm, Lothar Eggeling
- 单位
- Institute of Biotechnology, Research Centre Juelich, D-52425 Juelich, Germany
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2005）
- DOI
- 10.1128/JB.187.22.7639-7646.2005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
对谷氨酸棒杆菌基因组预测的20个氨基转移酶蛋白进行系统的功能鉴定，以明确其在氨基酸合成和代谢中的具体作用。
研究策略
克隆全部20个候选氨基转移酶基因并在大肠杆菌中异源表达和纯化，通过体外酶活测定确定底物特异性；同时构建系列基因缺失突变体，结合体内生长表型分析各酶在氨基酸合成中的生理功能。
核心内容
该研究对谷氨酸棒杆菌基因组中预测的全部20个氨基转移酶基因进行了系统克隆，并在大肠杆菌中异源表达纯化，通过体外酶活测定确认底物特异性，同时构建单基因缺失突变体并结合生长表型分析各酶的生理功能。结果显示，IlvE以L-谷氨酸为氨基供体时，对2-氧代异己酸和2-氧代异戊酸的比活分别为13.9和13.7 μmol min⁻¹ mg⁻¹；AvtA以L-丙氨酸为供体时对缬氨酸前体2-氧代异戊酸的比活达18.2 μmol min⁻¹ mg⁻¹；AlaT催化丙酮酸转氨生成丙氨酸的比活为26.6 μmol min⁻¹ mg⁻¹。体内敲除实验表明，ΔilvE突变体需添加异亮氨酸和亮氨酸才能生长而缬氨酸非必需，ΔilvEΔavtA双突变体则绝对依赖缬氨酸，ΔalaT突变体在固体培养基上需补充L-丙氨酸。该工作首次从全基因组水平完成了细菌全部氨基转移酶的功能注释，揭示了支链氨基酸、芳香族氨基酸和丙氨酸合成中多个转氨酶存在重叠底物特异性与明确生理分工，为谷氨酸棒杆菌氨基酸生产菌株的定向代谢改造奠定了理论基础。
创新点
首次从全基因组水平系统分析一个细菌的全部氨基转移酶，鉴定出AlaT、AvtA、AroT等新酶，并揭示多个转氨酶在支链和芳香族氨基酸合成中的重叠底物特异性。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum | 支链氨基酸合成 | ilvE (NCgl2123) | IlvE | 催化 | 对支链氨基酸前体活性高，是L-异亮氨酸和L-亮氨酸合成的主要转氨酶。 |
| Corynebacterium glutamicum | 缬氨酸合成 | avtA (NCgl2510) | AvtA | 催化 | 以L-丙氨酸为氨基供体，对2-氧代异戊酸和2-氧代丁酸活性高，与IlvE在缬氨酸合成中功能重叠。 |
| Corynebacterium glutamicum | 丙氨酸合成 | alaT (NCgl2747) | AlaT | 催化 | 对丙酮酸活性最高，ΔalaT突变体在固体培养基上需要L-丙氨酸。 |
| Corynebacterium glutamicum | 芳香族氨基酸合成 | aroT (NCgl0215) | AroT | 催化 | 对苯丙酮酸活性高，与IlvE在苯丙氨酸合成中功能重叠。 |
| Corynebacterium glutamicum | 天冬氨酸合成 | aspT (NCgl0237) | AspT | 催化 | 鉴定为天冬氨酸转氨酶。 |
| Corynebacterium glutamicum | 赖氨酸合成 | dapC (NCgl1058) | DapC | 催化 | 琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶，比活1.2 μmol min−1 mg−1。 |
| Corynebacterium glutamicum | 精氨酸合成 | argD (NCgl1343) | ArgD | 催化 | 乙酰鸟氨酸转氨酶，比活6.4 μmol min−1 mg−1。 |
| Corynebacterium glutamicum | Fe-S簇组装 | sufS (NCgl1500) | SufS | 催化 | 半胱氨酸脱硫酶，属于sufABCDS操纵子，比活0.35 μmol min−1 mg−1。 |
| Corynebacterium glutamicum | NAD合成 | NCgl1022 | NCgl1022 | 催化 | 半胱氨酸脱硫酶，比活0.04 μmol min−1 mg−1。 |
| Corynebacterium glutamicum | 电子传递黄素蛋白Fe-S簇组装 | NCgl1184 | NCgl1184 | 催化 | 半胱氨酸脱硫酶，与脂质合成和电子传递黄素蛋白基因共线性。 |
| Corynebacterium glutamicum | 组氨酸合成 | hisC (NCgl2020) | HisC | 催化 | 组氨醇磷酸转氨酶。 |
| Corynebacterium glutamicum | 吡哆醛磷酸合成 | pdxR (NCgl0753) | PdxR | 催化 | 吡哆胺磷酸转氨酶。 |
| Corynebacterium glutamicum | 生物素合成 | bioA (NCgl2515) | BioA | 催化 | AdoMet-氨基氧壬酸转氨酶。 |
| Corynebacterium glutamicum | 卟啉合成 | hemL (NCgl0422) | HemL | 催化 | 谷氨酸-1-半醛转氨酶，对琥珀酰二氨基庚二酸活性极低。 |
| Corynebacterium glutamicum | 甲硫氨酸合成 | metC (aecD, NCgl2227) | MetC | 催化 | 胱硫醚β-裂解酶，属PLP酶，非转氨酶。 |
| Corynebacterium glutamicum | 丁酸代谢 | NCgl0462 | NCgl0462 | 催化 | 可能为4-氨基丁酸转氨酶，参与丁酸代谢。 |
关键发现
- IlvE以L-谷氨酸为氨基供体时，对2-氧代-3-甲基戊酸、2-氧代异己酸、2-氧代异戊酸和2-氧代丁酸的比活分别为9.6、13.9、13.7和4.3 μmol min−1 mg−1
- AvtA以L-丙氨酸为供体时，对上述底物的比活分别为3.7、0.9、18.2和27.5 μmol min−1 mg−1
- AlaT以L-谷氨酸为供体、丙酮酸为受体时比活为26.6 μmol min−1 mg−1
- AroT对苯丙酮酸的比活为13.6 μmol min−1 mg−1，IlvE对苯丙酮酸为10.7 μmol min−1 mg−1
- AspT对2-氧代戊二酸的比活为10.7 μmol min−1 mg−1
- SufS半胱氨酸脱硫酶比活为0.35 μmol min−1 mg−1。ΔilvE突变体需添加异亮氨酸和亮氨酸才能生长，但缬氨酸非必需
- ΔilvEΔavtA双突变体则绝对需要缬氨酸
- ΔalaT突变体在固体培养基上需补充L-丙氨酸。
研究结论
通过结合体外活性测定和体内基因敲除分析，完成了谷氨酸棒杆菌20个氨基转移酶的功能注释，揭示了支链氨基酸、芳香族氨基酸、丙氨酸等合成中多个转氨酶的重叠底物特异性和生理分工，为氨基酸生产菌株的定向改造提供了理论基础。