The Wax Ester Synthase/Acyl Coenzyme A:Diacylglycerol Acyltransferase from Acinetobacter sp. Strain ADP1: Characterization of a Novel Type of Acyltransferase
- 作者
- Tim Stöveken, Rainer Kalscheuer, Ursula Malkus, Rudolf Reichelt, Alexander Steinbüchel
- 单位
- Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie; Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Universitätsklinikum; Westfälische Wilhelms-Universität Münster
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2005）
- DOI
- 10.1128/JB.187.4.1369-1376.2005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
表征来自Acinetobacter sp. strain ADP1的新型酰基转移酶WS/DGAT的生化特性，该酶催化三酰甘油和蜡酯生物合成的最后步骤，与真核生物中已知的酰基转移酶完全不同。
研究策略
通过T7启动子pET系统在E. coli Rosetta(DE3)pLysS中异源表达atfA基因，经三步层析纯化获得均一酶蛋白，系统测定其底物特异性、动力学参数、寡聚状态及亚细胞定位。
核心内容
该研究从Acinetobacter sp. ADP1中克隆了atfA基因，编码一种新型的蜡酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶（WS/DGAT），并通过T7启动子pET系统在E. coli中异源表达。经三步层析纯化，酶蛋白富集18.7倍，收率19.2%，SDS-PAGE显示表观分子量为53 kDa，天然分子量为94.1±3.9 kDa，证实其以同源二聚体形式存在。系统生化表征显示该酶最适温度40–45°C，最适pH 8.0，对palmitoyl-CoA的Km为29 μM，Vmax为2000 nmol mg⁻¹ min⁻¹。底物谱分析表明，该酶兼具DGAT、WS和MGAT三种活性，对C14–C18线性醇活性最高，对palmitoyl-CoA（C16）特异性最强；对环己醇、苯乙醇、环十二醇等非典型底物均有酰化活性，活性分别为己醇对照的99.0%和79.7%，而对苯酚、环己烷二醇活性极低（4.1%）。亚细胞定位显示该酶主要与细胞质膜及脂质包含体结合。这一发现揭示WS/DGAT是高度非特异性的多功能酰基转移酶，为细菌三酰甘油和蜡酯生物合成提供了全新的酶学基础，并可作为致病分枝杆菌同源蛋白的研究模型，为抗结核药物开发提供潜在靶点。
创新点
首次将细菌WS/DGAT纯化至表观均一；证明该酶具有DGAT、WS和MGAT三种活性；揭示其对线性、环状、芳香族醇及多种酰基甘油具有极广泛的底物范围；发现其以同源二聚体形式存在且部分定位于细胞质。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS | 三酰甘油和蜡酯生物合成 | atfA | WS/DGAT | 催化 | 异源表达宿主，用于纯化和生化表征 |
| Acinetobacter sp. strain ADP1 | 三酰甘油和蜡酯生物合成 | atfA | WS/DGAT | 催化 | 天然宿主，酶催化WE和TAG合成的最后步骤 |
| Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS | 三酰甘油和蜡酯生物合成 | atfA | WS/DGAT | 催化 | 纯化后的酶具有MGAT活性，可酰化单酰甘油 |
| Acinetobacter sp. strain ADP1 | 脂质储存代谢 | — | WS/DGAT | 区室化 | 免疫金标记显示酶主要与细胞质膜和脂质包含体结合，少量在细胞质中 |
关键发现
- WS/DGAT经三步纯化富集18.7倍，收率19.2%，SDS-PAGE表观分子量53 kDa，凝胶过滤天然分子量94.1±3.9 kDa，为同源二聚体。最适温度40-45°C，最适pH 8.0。对palmitoyl-CoA的Km为29 μM，Vmax为2000 nmol mg-1 min-1。游离CoA在300-1000 μM时抑制约70%活性。底物偏好：对C14-C18线性醇活性最高，对palmitoyl-CoA（C16）特异性最高
- 对sn-1和sn-3位羟基层度高于sn-2位
- 环己醇、苯乙醇、环十二醇等均可被酰化，活性分别为己醇对照的32.0%、99.0%、79.7%
- 苯酚活性4.1%，环己烷二醇4.1%，环己酮肟5.2%。对1-、2-、4-癸醇活性分别为己醇的48.0%、38.6%、15.6%。MGAT活性中，1-MPG转化为1,3-DPG的速率为373±16 nmol mg-1 min-1，2-MPG转化为1,3-DPG为99±11 nmol mg-1 min-1。亚细胞定位显示WS/DGAT主要与细胞质膜和脂质包含体结合，少量存在于细胞质。
研究结论
WS/DGAT是一种高度非特异性的新型酰基转移酶，兼具DGAT、WS和MGAT活性，底物谱极广。该酶的纯化与表征为理解细菌TAG和WE生物合成提供了基础，且其作为致病分枝杆菌中同源蛋白的模型，可能为结核病等疾病的药物研发提供新靶点。