The frdR Gene of Escherichia coli Globally Regulates Several Operons Involved in Anaerobic Growth in Response to Nitrate
- 作者
- LISA V. KALMAN, ROBERT P. GUNSALUS
- 单位
- Department of Microbiology, University of California Los Angeles; Molecular Biology Institute, University of California Los Angeles
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1988）
- DOI
- 10.1128/jb.170.2.623-629.1988
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中硝酸盐对延胡索酸还原酶（frdABCD）操纵子表达的抑制机制，以及参与硝酸盐调控的反式作用因子的鉴定。
研究策略
利用亚硝基胍诱变筛选在硝酸盐存在下仍表达frdA'-lacZ的突变株，通过遗传作图和P1转导定位突变基因，并利用质粒文库互补克隆frdR基因；通过测定β-半乳糖苷酶、延胡索酸还原酶、硝酸盐还原酶、TMAO还原酶和乙醇脱氢酶活性表征其调控效应。
核心内容
该研究通过亚硝基胍诱变筛选出在硝酸盐存在下仍表达frdA'-lacZ的大肠杆菌突变株LK23R35，经遗传作图和P1转导将突变定位于27分钟处，并利用质粒文库互补克隆了frdR基因。实验表明，frdR编码一种硝酸盐应答的全局调控蛋白：在野生型中，硝酸盐厌氧条件下对frdA'-lacZ表达抑制达27倍，而突变株中几乎无抑制，β-半乳糖苷酶活性比野生型高17倍；延胡索酸还原酶活性在突变株中比野生型高14倍。该调控蛋白还负调控TMAO还原酶和乙醇脱氢酶基因（后者在野生型中被硝酸盐抑制34倍，突变株中约22 U不受影响），同时正调控硝酸盐还原酶基因（野生型中诱导25倍，突变株中不被诱导）。4.9kb的HindIII片段pLK2可恢复frdR+表型，基因顺序为hemA-frdR-kan-trp。该发现揭示了大肠杆菌以硝酸盐为信号，通过FrdR全局协调多种厌氧呼吸途径，优先利用高能量产率电子受体的调控机制。
创新点
首次鉴定并克隆了frdR基因，证明其编码一种硝酸盐应答的全局调控蛋白，同时负调控frdABCD、TMAO还原酶和乙醇脱氢酶基因，正调控硝酸盐还原酶基因。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K-12 | 延胡索酸厌氧呼吸 | frdABCD | 延胡索酸还原酶复合体（FrdA-FrdD） | 催化 | 催化延胡索酸还原为琥珀酸，是厌氧电子传递的末端步骤 |
| Escherichia coli K-12 | 硝酸盐呼吸 | narGHI | 硝酸盐还原酶 | 催化 | 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，受硝酸盐诱导，frdR突变后诱导丧失 |
| Escherichia coli K-12 | TMAO呼吸 | 未指定（TMAO还原酶基因） | TMAO还原酶 | 催化 | 催化三甲胺氧化物还原，受硝酸盐抑制，frdR突变后解除抑制 |
| Escherichia coli K-12 | 乙醇发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 催化乙酰辅酶A还原为乙醇，硝酸盐抑制其在野生型中的表达，frdR突变后去抑制 |
| Escherichia coli K-12 | 全局调控 | frdR | FrdR调控蛋白 | 调控 | 作为硝酸盐响应的全局调控因子，负调控frdABCD/TMAO还原酶/乙醇脱氢酶，正调控硝酸盐还原酶，定位于27分钟 |
关键发现
- 突变株LK23R35在厌氧含硝酸盐培养时β-半乳糖苷酶活性比野生型高17倍
- 有氧含硝酸盐时高3.7倍。野生型菌株硝酸盐对frdA'-lacZ表达在厌氧下抑制27倍，在有氧下抑制3.8倍。突变株中硝酸盐对frdA'-lacZ几乎无抑制（仅1.1-2.4倍）。延胡索酸还原酶活性在突变株厌氧含硝酸盐时比野生型高14倍。硝酸盐还原酶在野生型中经硝酸盐诱导25倍，而突变株不被诱导。乙醇脱氢酶在野生型中被硝酸盐抑制34倍（27.0降至0.8 U），突变株中无抑制（21.9与22.4 U）。TMAO还原酶在突变株中解除硝酸盐抑制（含硝酸盐时活性反而升高）。frdR基因定位于27分钟，与trp和hemA连锁，基因顺序为hemA-frdR-kan-trp
- 9kb的HindIII片段（pLK2）可恢复frdR+表型。
研究结论
frdR基因编码的调控蛋白以硝酸盐为信号，全局调控多种厌氧呼吸和发酵相关基因的表达：抑制frdABCD、TMAO还原酶和乙醇脱氢酶，激活硝酸盐还原酶，从而确保细胞优先利用高能量产率的电子受体。