Manipulating Fermentation Pathways in the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus for Ethanol Production up to 95°C Driven by Carbon Monoxide Oxidation
- 作者
- Gina L. Lipscomb, Alexander T. Crowley, Diep M. N. Nguyen, Matthew W. Keller, Hailey C. O'Quinn, Tania N. N. Tanwee, Jason L. Vailonis, Ke Zhang, Ying Zhang, Robert M. Kelly, Michael W. W. Adams
- 单位
- Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, Athens, Georgia, USA; Department of Cell and Molecular Biology, College of the Environment and Life Sciences, University of Rhode Island, Kingston, Rhode Island, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2023）
- DOI
- 10.1128/AEM.00012-23
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
进一步提高极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus发酵产乙醇的温度，将工程化乙醇生产的最高温度从85°C提升至95°C，并利用一氧化碳氧化驱动乙醇合成。
研究策略
通过同源过表达P. furiosus内源乙醇脱氢酶AdhF（PF0608），并异源表达Thermococcus onnurineus的CO脱氢酶复合物（CODH），使菌株能在95°C利用CO作为能源合成乙醇；同时结合基因组规模代谢模型指导工程策略。
核心内容
该研究通过代谢工程策略，将极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的工程化乙醇生产温度由85°C提升至95°C，并首次实现该温度下以CO氧化驱动的乙醇合成。研究同源过表达内源乙醇脱氢酶AdhF（PF0608），并异源引入Thermococcus onnurineus的CODH复合物，结合基因组规模代谢模型指导工程改造。结果显示，95°C下过表达AdhF的菌株在20-L发酵罐中乙醇产量达12 mM，乙醇/乙酸比0.9；含CODH菌株在CO条件下摇瓶乙醇产量最高5.8 mM（15 h），对照为3.5 mM，氢产量分别67和28 mM，乙醇/乙酸比由<0.5提升至1.4。途径分析揭示温度依赖性转变：75°C时乙醛主要由AOR产生，95°C时主要由POR侧反应提供。缺失adhF在95°C下不产乙醇，而ΔAOR菌株产乙醇0.8 mM，对照0.6 mM。基因组模型预测引入CODH后乙酸中位数由22.48降至10.69 mM，乙醇由5.62升至7.64 mM。该策略验证了高温发酵与直接蒸馏结合的“生物反应蒸馏”可行性，为高温工业生物技术提供了新平台。
创新点
首次实现95°C下异源工程化乙醇生产；揭示不同温度下乙醇合成途径的转变：75°C时乙醛主要由AOR产生，95°C时主要由POR侧反应提供；利用CODH复合物以CO为能源驱动乙醇合成并提高乙醇/乙酸比。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pyrococcus furiosus | 乙醇合成途径 | adhF (PF0608) | AdhF (乙醇脱氢酶F) | 催化 | 内源乙醇脱氢酶，负责95°C下乙醇生成；过表达使乙醇产量大幅提高。 |
| Pyrococcus furiosus | 乙酸/乙醛转化途径 | aor | AOR (醛铁氧还蛋白氧化还原酶) | 催化 | 在75°C下将乙酸还原为乙醛以供应AdhF；95°C下作用可忽略。 |
| Pyrococcus furiosus | 丙酮酸代谢 | porA (POR基因簇) | POR (丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶) | 催化 | 95°C下通过氧化脱羧侧反应将丙酮酸转化为乙醛，为主要乙醛来源。 |
| Pyrococcus furiosus | 一氧化碳氧化产能途径 | 16-基因CODH簇 (来自Thermococcus onnurineus) | CODH复合物 (含CO脱氢酶、膜结合[NiFe]氢酶和Na+/H+反向转运体) | 能量供给 | 异源表达使菌株能利用CO氧化产生能量，提高乙醇产量和乙醇/乙酸比。 |
| Pyrococcus furiosus | 氢代谢/能量代谢 | mbh操纵子 (未明确指定基因) | MBH (膜结合氢酶复合物) | 能量供给 | 通过产H2回收还原态铁氧还蛋白，维持胞内氧化还原平衡并生成钠离子梯度驱动ATP合成。 |
关键发现
- 在95°C下，过表达AdhF的菌株在20-L发酵罐中乙醇产量达到12 mM，乙醇/乙酸比为0.9
- 在摇瓶培养中，含CODH的菌株在CO条件下乙醇产量最高达5.8 mM（15 h），对照OE-AdhF为3.5 mM，H2产量分别为67 mM和28 mM，乙醇/乙酸比从<0.5提升至1.4
- 静态富培养基中三个AdhF过表达菌株乙醇产量为5.0-5.8 mM
- 在95°C最小培养基中过表达菌株乙醇约2 mM，而ΔadhF菌株不产乙醇
- 在75°C下ΔadhF菌株乙醇<0.2 mM，ΔAOR菌株产乙醇0.4 mM（对照0.2 mM）
- 95°C下ΔAOR产乙醇0.8 mM（对照0.6 mM）
- adhA和adhB在75°C表达比对照低约10倍
- 基因组模型预测有CODH时乙酸中位数从22.48降至10.69 mM，乙醇中位数从5.62升至7.64 mM。
研究结论
工程化P. furiosus菌株可在95°C利用CO氧化驱动乙醇生产，过表达AdhF并引入CODH显著提高乙醇产量和乙醇/乙酸比，验证了高温发酵结合直接蒸馏的'生物反应蒸馏'可行性，为高温工业生物技术提供了新平台。