Thermotolerant Yeast Strains Adapted by Laboratory Evolution Show Trade-Off at Ancestral Temperatures and Preadaptation to Other Stresses
- 作者
- Luis Caspeta, Jens Nielsen
- 单位
- Centro de Investigacion en Biotecnologia, Universidad Autonoma del Estado de Morelos, Cuernavaca, Morelos, Mexico; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Chalmers University of Technology, Gothenburg, Sweden; Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, Gothenburg, Sweden; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Hørsholm, Denmark
- 杂志
- mBio（2015）
- DOI
- 10.1128/mBio.00431-15
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母在高温（≥40°C）条件下生长和发酵性能差，限制纤维素乙醇生产的经济性，缺乏对耐热性遗传基础及生理功能变化的系统认识。
研究策略
利用前期通过适应性实验室进化获得的7株耐热酵母菌株（TTSs），系统测定其在15–50°C范围内的生长速率、代谢产物，结合蛋白质组热稳定性计算模型，分析热适应导致的生长权衡、蛋白稳定性变化及对其他胁迫（高渗、乙醇、高糖、乙酸、过氧化氢）的预适应能力。
核心内容
该研究系统评估了7株通过适应性实验室进化获得的耐热酿酒酵母菌株在15至50°C范围内的生长与发酵性能。结果显示，耐热菌株在40°C下的生长速率、葡萄糖消耗和乙醇生产速率分别比野生型快1.92、1.50和1.60倍，最高生长温度从约42°C升至45°C；但在低温区间出现生长权衡，最优生长温度从约31°C上移至34°C，且甘油产量约为野生型3倍、生物量降低35%。蛋白质组热稳定性计算预测致死温度约49°C，此温度下0.86%的蛋白质可能去折叠，随温度升高该比例急剧上升。耐热菌株表现出对高渗和乙醇胁迫的预适应，在1M KCl和8%乙醇下生长速率分别为野生型的2.0和1.2倍。遗传分析表明耐热性源于呼吸链功能丧失、麦角固醇被fecosterol替代以及减少生长相关蛋白合成等变化。这些结果揭示了热适应以祖先温度下生长性能为代价换取高温优势的权衡机制，并表明耐热菌株兼具渗透压和乙醇耐受性，对降低纤维素乙醇工业生产成本具有实际意义。
创新点
揭示了耐热酵母菌株在祖先温度下出现生长权衡，并伴随最优生长温度上移约3°C；通过计算蛋白质组折叠自由能预测酵母致死温度约49°C；发现呼吸链功能丧失与甘油过量产生相关，且耐热菌株渗透压和乙醇耐受性提高。
研究对象（19）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 甾醇合成 | ERG3 | — | 催化 | 无义突变导致麦角固醇合成障碍，膜甾醇被fecosterol替代，恢复80%的耐热表型 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 呼吸链 | ATP2 | ATP合酶β亚基 | 能量供给 | 无义突变导致呼吸链功能丧失，降低生长相关功能数量，与甘油过量产生相关 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 呼吸链 | ATP3 | ATP合酶γ亚基 | 能量供给 | 无义突变导致呼吸链功能丧失 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 甘油合成代谢 | GPD1 | 甘油-3-磷酸脱氢酶1 | 催化 | 通过GPD1/2将DHAP还原为G3P，是呼吸缺陷时细胞质NADH再生为NAD+的唯一途径 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 甘油合成代谢 | GPD2 | 甘油-3-磷酸脱氢酶2 | 催化 | 与GPD1共同催化DHAP生成G3P，促进甘油积累 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性信号通路（PKC-MAP） | SLT2 | 丝裂原活化蛋白激酶 | 调控 | 在耐热菌株中轻微下调，与细胞壁完整性相关 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 高渗透压甘油反应（HOG）信号通路 | HOG1 | 高渗透压甘油反应蛋白激酶 | 调控 | 在耐热菌株中表达无显著变化，但可能通过HAP1影响甘油积累 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性信号通路 | SMP1 | MEF2样转录因子 | 调控 | 调控PKC-MAP通路，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性信号通路 | RLM1 | MADS盒转录因子 | 调控 | 调控PKC-MAP通路，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 孢子形成及SVG通路 | STE12 | 转录因子Ste12 | 调控 | 参与SVG通路，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性 | CWP1 | 细胞壁甘露蛋白 | 调控 | 细胞壁强化/通透性相关基因，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性 | HSP150 | 热激蛋白150 | 调控 | 细胞壁蛋白，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性 | PIR1 | 含重复序列蛋白1 | 调控 | 细胞壁蛋白，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 细胞壁完整性 | PIR3 | 含重复序列蛋白3 | 调控 | 细胞壁蛋白，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 几丁质合成 | CHS3 | 几丁质合酶3 | 催化 | 受PKC-MAP和SVG通路调控，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 葡聚糖重构 | CRH1 | 几丁质转糖基酶 | 催化 | 受RLM1和STE12调控，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 葡聚糖重构 | BGL2 | β-1,3-葡聚糖酶 | 催化 | 受RLM1和STE12调控，在耐热菌株中下调 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 酵母蛋白组热稳定性 | — | 全体蛋白 | 调控 | 计算显示致死温度约49°C，TTSs的Γ值从215降至144，减少了生长相关功能数 |
| Saccharomyces cerevisiae CENPK113-7D | 氨基酸生物合成 | MTM1 | 线粒体载体蛋白 | 转运 | 含有甘氨酸到精氨酸的替换，可能影响蛋白稳定性 |
关键发现
- 耐热菌株在40°C下生长速率、葡萄糖消耗和乙醇生产速率分别比野生型快1.92、1.50和1.60倍
- 最优生长温度从15–34°C范围内野生型的~31°C升至~34°C，最高生长温度从~42°C升至~45°C
- 在低温（15–34°C）下TTSs甘油产量约为野生型的3倍，生物量产量降低35%
- 蛋白质组热稳定性计算显示49°C时0.86%的蛋白质（包括21个必需蛋白）可能去折叠，50°C、51°C、53°C时分别为10.4%、27.9%、60.5%
- 生长速率决定蛋白数量Γ从215降至144
- 在95 g/L葡萄糖条件下24h发酵，TTSs完全消耗葡萄糖并产生42g/L乙醇，野生型残留21g/L葡萄糖、产26.6g/L乙醇，乙醇生产力分别为1.75 g/L/h和1.1 g/L/h
- 在1M KCl和8%（vol/vol）乙醇胁迫下，TTSs生长速率分别为野生型的2.0和1.2倍。
研究结论
通过适应性实验室进化获得的耐热酵母菌株在高温下表现出更好的生长和发酵性能，但以牺牲祖先温度下生长为代价；其耐热性源于蛋白质组稳定性需求降低（减少生长相关功能）以及甾醇组成改变（麦角固醇被fecosterol替代）等遗传变化。这些菌株对高渗和乙醇胁迫具有预适应性，有助于降低工业乙醇生产成本。