Fusarium Tri4 encodes a multifunctional oxygenase required for trichothecene biosynthesis
- 作者
- Susan P. McCormick, Nancy J. Alexander, Robert H. Proctor
- 杂志
- Canadian Journal of Microbiology（2006）
- DOI
- 10.1139/w06-011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Fusarium graminearum Tri4（FgTri4）在单端孢霉烯生物合成中的确切功能，即其是否催化多个氧化步骤。
研究策略
将F. graminearum的Tri4基因在非产毒真菌Fusarium verticillioides中异源表达，并饲喂前体trichodiene，通过分析中间产物及利用宿主自身酶活和非酶反应推断Tri4的功能。
核心内容
该研究将禾谷镰刀菌的Tri4基因在非产毒真菌轮枝镰刀菌中异源表达，以阐明其编码酶在单端孢霉烯生物合成中的确切功能。在饲喂368 μmol/L前体trichodiene的条件下，21个转化体中有6株能将其完全代谢，4天内主要产物为isotrichodermin并伴有少量trichothecene生成。通过分析中间产物并结合宿主自身酶活及非酶反应，证明Tri4编码一种多功能P450单加氧酶，催化从trichodiene到isotrichodermin途径中的四个连续氧化步骤。此外，实验发现轮枝镰刀菌自身具有三氯萘酚C-3乙酰转移酶活性，能将isotrichodermol完全转化为isotrichodermin。RT-PCR确认FgTri4在转化体中成功表达。该研究首次在轮枝镰刀菌中实现FgTri4的功能表征，不仅明确了Tri4催化单端孢霉烯生物合成前四步氧化反应，也建立了研究镰刀菌P450基因的有效异源表达系统，为后续该类真菌毒素合成途径的酶学解析提供了重要工具。
创新点
1. 首次在F. verticillioides中成功异源表达FgTri4并表征其功能；2. 证明Tri4是一种多功能P450单加氧酶，催化trichodiene至isotrichodermin途径中的四个氧化步骤；3. 发现F. verticillioides具有trichothecene C-3乙酰转移酶活性；4. 建立了研究镰刀菌P450基因的有效异源表达系统。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fusarium verticillioides M-3125 | 单端孢霉烯生物合成途径 | Fusarium graminearum Tri4 (FgTri4) | Tri4 P450单加氧酶 | 催化 | 异源表达后转化外源trichodiene，催化前四个氧化步骤 |
| Fusarium verticillioides M-3125 | 单端孢霉烯生物合成途径 | Tri101（或同源乙酰转移酶基因） | trichothecene C-3乙酰转移酶 | 催化 | 宿主自身活性，将isotrichodermol转化为isotrichodermin |
| Fusarium graminearum Z-3639 | 单端孢霉烯生物合成途径 | Tri4 | Tri4蛋白 | 催化 | 内源Tri4，被克隆并在异源宿主中表达 |
关键发现
- 在368 μmol/L trichodiene饲喂条件下，21个转化体中6株能代谢trichodiene，于4天内完全转化，主要产物为isotrichodermin（保留时间11.8 min），并产生少量trichothecene（保留时间8.2 min）
- GYAM培养基（pH 2.6）中isotrichodiol和isotrichotriol可非酶转化为trichothecene和isotrichodermol
- 野生型F. verticillioides可在1天内将isotrichodermol完全乙酰化为isotrichodermin
- RT-PCR证实FgTri4在转化体中表达（cDNA片段599 bp，基因组DNA片段720 bp）
- FgTri4编码区PCR产物为2175 bp。
研究结论
Tri4编码一种多功能单加氧酶，催化F. graminearum中15-ADON生物合成的前四个氧化步骤；F. verticillioides具有trichothecene C-3乙酰转移酶活性，且该菌是异源表达镰刀菌P450基因的有效宿主。