Biofuels: Biomolecular Engineering Fundamentals and Advances
- 作者
- Han Li, Anthony F. Cann, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, California 90095
- 杂志
- Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering（2010）
- DOI
- 10.1146/annurev-chembioeng-073009-100938
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过生物分子工程扩展生物燃料产品谱，从乙醇、脂肪酸甲酯扩展到高级醇、烷烃等，同时解决碳链延伸、功能修饰、代谢平衡、菌株耐受性和工业生产效率等关键问题。
研究策略
综述了三条主要碳链延伸途径（酮酸延伸、脂肪酸延伸、异戊二烯延伸）及其功能化修饰，结合理性设计与组合策略（如蛋白质工程、全局转录机器工程、代谢进化）来优化宿主代谢网络，并整合生物质降解与发酵工艺。
核心内容
该综述系统梳理了生物分子工程在拓展生物燃料产品谱方面的进展，聚焦于碳链延伸与功能化修饰两大核心问题。作者归纳了三条主要碳链延伸途径，即酮酸延伸、脂肪酸延伸和异戊二烯延伸，并讨论了如何通过理性设计与组合策略（如蛋白质工程、全局转录机器工程和代谢进化）优化宿主代谢网络，同时整合生物质降解与发酵工艺。关键结果方面，重组大肠杆菌利用异源丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶可实现接近理论极限的乙醇产率，工程菌株通过引入乙酰乳酸合酶、α-酮异戊酸脱羧酶和醇脱氢酶等，使异丁醇产量超过20 g/L，达到理论产率的85%；异戊烯醇产量为112 mg/L，番茄红素最高达9000 ppm。此外，蛋白质工程改造的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶显著提升了木糖乙醇产率，SCHEMA重组纤维素酶CBH II具有更高热稳定性和更宽pH活性谱。这些结果表明，通过代谢工程与蛋白质工程优化基因组合、酶活性及宿主网络，并增强菌株耐受性，可有效扩大燃料分子种类并推动可持续生物燃料生产。
创新点
提出了基于酮酸脱羧-还原途径的高效高级醇合成策略；通过蛋白质工程扩展IPMS和KDC底物谱；利用组合基因组工程优化异戊二烯途径；开发了引入异源脂肪酸硫酯酶以调节链长；设计人工纤维素小体与热稳定纤维素酶；实现直接由CO2光合合成异丁醇。
研究对象（24）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 同型乙醇发酵 | pdc, adhB | 丙酮酸脱羧酶，醇脱氢酶B | 催化 | 来自运动发酵单胞菌的PET操纵子整合至染色体pfl位点，删除frd，构建菌株KO11，乙醇产率达95% |
| Escherichia coli | 乙醇发酵 | frd | 富马酸还原酶 | 催化 | 敲除以减少琥珀酸副产物，防止碳流失 |
| Escherichia coli | 乙醇发酵 | PDH operon | 丙酮酸脱氢酶复合体 | 催化 | 突变体在厌氧条件下有活性，菌株SE2378无需外源基因即可产乙醇82% |
| Saccharomyces cerevisiae | 木糖乙醇发酵 | XYL1, XYL2 | 木糖还原酶，木糖醇脱氢酶 | 催化 | 来自毕赤酵母，通过蛋白质工程改变辅酶特异性以解决NADPH/NAD+不平衡 |
| Escherichia coli | 异丙醇合成 | sadh | 二级醇脱氢酶 | 催化 | 与丙酮酸生产途径偶联，将丙酮转化为异丙醇，最高产量4.9 g/L |
| Escherichia coli | 异丁醇合成（酮酸延伸） | alsS | 乙酰乳酸合酶（来自枯草芽孢杆菌） | 催化 | 具有AHAS和酮酸脱羧酶双重活性，用于异丁醇生产 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成（酮酸延伸） | kivD | α-酮异戊酸脱羧酶（来自乳酸乳球菌） | 催化 | 用于2-酮异戊酸脱羧，后续加氢生成异丁醇 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成（酮酸延伸） | yqhD | YqhD醇脱氢酶 | 催化 | NADH依赖，是异丁醇生产中最活跃的ADH之一 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成（酮酸延伸） | adhA | AdhA醇脱氢酶（来自乳酸乳球菌） | 催化 | NADPH依赖，可提供辅因子特异性选择 |
| Escherichia coli | 异丁醇合成（酮酸延伸） | adh2 | 醇脱氢酶II（来自酿酒酵母） | 催化 | 亦可还原异丁醛为异丁醇 |
| Escherichia coli | 3-甲基-1-丁醇合成（酮酸延伸） | leuABCD | 异丙基苹果酸合酶等亮氨酸合成酶 | 催化 | 催化2-酮异戊酸延伸为2-酮-4-甲基戊酸，再脱羧还原为3-甲基-1-丁醇 |
| Escherichia coli | 1-丙醇/1-丁醇合成（酮酸延伸） | cimA | 柠苹酸合酶（来自詹氏甲烷球菌，人工进化） | 催化 | 催化丙酮酸延伸为2-酮丁酸，进而合成1-丙醇或1-丁醇 |
| Escherichia coli | C5-C8高级醇合成（酮酸延伸） | leuA突变体 | 异丙基苹果酸合酶突变体 | 催化 | 结构导向蛋白工程改造底物结合口袋，可进行多轮延伸，最高产生C9酮酸 |
| Escherichia coli | 脂肪酸合成 | ACC | 乙酰-CoA羧化酶 | 催化 | 过表达以增加丙二酰-CoA供给，促进脂肪酸链延伸 |
| Escherichia coli | 脂肪酸β-氧化 | fadD | 酰基-CoA合成酶 | 催化 | 敲除以阻断脂肪酸降解，提高脂肪酸积累 |
| Escherichia coli | 脂肪酸合成 | 植物硫酯酶 | 脂肪酰-ACP硫酯酶 | 催化 | 异源表达植物硫酯酶，提前终止延伸链，主要产生C12-C14脂肪酸 |
| Escherichia coli | 脂肪酸乙酯合成 | ws/dgat | 蜡酯合酶/酰基-CoA二酰甘油酰基转移酶（来自不动杆菌属） | 催化 | 与乙醇合成途径偶联，生成脂肪酸乙酯（FAEE） |
| Escherichia coli | 异戊二烯合成（DXP途径） | dxs, idi, dxr | DXP合酶，IPP异构酶，DXP还原异构酶 | 催化 | 过表达以增强异戊二烯前体IPP/DMAPP供应 |
| Escherichia coli | 异戊二烯合成（DXP途径） | rpoS | RNA聚合酶σS亚基 | 调控 | 全局应激调控因子，过表达促进番茄红素产量 |
| Escherichia coli | 甲羟戊酸途径 | atoB, HMGS, HMGR | 乙酰-CoA乙酰转移酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA还原酶 | 催化 | 引入酵母甲羟戊酸途径，增强IPP前体供给 |
| Escherichia coli | 异戊烯醇合成 | nudF | NudF水解酶（来自枯草芽孢杆菌） | 催化 | 与甲羟戊酸途径偶联，异戊烯醇产量达112 mg/L |
| Escherichia coli | 番茄红素合成 | crtEBI | GGPP合酶，八氢番茄红素合酶，八氢番茄红素去饱和酶 | 催化 | 组合工程优化表达，最高产量9000 ppm |
| Escherichia coli | 异戊二烯链延伸 | GGPP合酶（来自Archaeoglobus fulgidus） | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 工程化以提高C20产物GGPP产量 |
| 丝状真菌（如木霉源） | 纤维素降解 | CBH II | II型纤维二糖水解酶 | 催化 | 通过SCHEMA结构引导重组获得热稳定性提高、pH-活性谱更宽的嵌合酶 |
关键发现
- 乙醇在天然宿主中产量可达理论最大值的95%（0.51 g/g葡萄糖）
- 重组大肠杆菌KO11产乙醇高达95%理论产率
- 大肠杆菌SE2378（无外源基因）可产乙醇82%产率
- 产溶剂梭菌BA101总溶剂产量达33 g/L
- 重组大肠杆菌产异丙醇4.9 g/L，1-丁醇550 mg/L
- 重组酵母产1-丁醇2.5 mg/L
- 工程大肠杆菌产异丁醇超过20 g/L，为理论产率的85%
- 异戊烯醇产量达112 mg/L
- 番茄红素最高产量9000 ppm
- 蛋白质工程改造的木糖还原酶/木糖醇脱氢酶显著提高木糖乙醇产率
- SCHEMA重组的纤维素酶CBH II具有更高热稳定性和更宽pH活性谱。
研究结论
生物燃料生产本质上是一个工程问题，但分子生物学、代谢工程和系统生物学的发展已扩展了燃料分子和宿主平台的选择。酮酸链延伸、脂肪酸链延伸和异戊二烯延伸三条途径可提供多种合适的碳氢燃料；通过代谢工程和蛋白质工程优化基因组合、酶活性和宿主网络，并增强菌株耐性与鲁棒性，有助于实现可持续燃料生产。