Metabolic engineering of Pseudomonas sp. strain VLB120 as platform biocatalyst for the production of isobutyric acid and other secondary metabolites
- 作者
- Karsten Lang, Jessica Zierow, Katja Buehler, Andreas Schmid
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2014）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-13-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在需氧菌 Pseudomonas sp. strain VLB120 中建立异丁酸及其他次级代谢产物的发酵生产平台，以克服兼性厌氧菌（如大肠杆菌）发酵时副产物多、碳收率低的问题。
研究策略
通过引入 Ehrlich 途径（过表达 2-酮酸脱羧酶 kivd），结合缬氨酸合成途径基因（alsS、ilvC、ilvD）的过表达，利用 T7 表达系统提高表达水平；通过定向敲除 bkd（支链α-酮酸脱氢酶）和随机突变（NTG）阻断产物降解，并删除竞争途径（ilvE、leuA、panB、pycAB）以增加前体 2-酮异戊酸（2-KIV）的碳通量。
核心内容
本研究以需氧菌Pseudomonas sp. strain VLB120为底盘，旨在建立异丁酸及其他次级代谢产物的好氧发酵平台，以克服兼性厌氧菌碳收率低、副产物多的局限。研究通过引入Ehrlich途径关键基因kivd，并过表达缬氨酸合成途径基因alsS、ilvC和ilvD，同时采用T7表达系统替代原有Alk启动子以提高表达水平。此外，通过定向敲除bkd阻断异丁酸降解，结合NTG随机突变删除竞争途径基因ilvE、leuA、panB和pycAB以增加前体2-酮异戊酸的碳通量。结果显示，过表达kivd后菌株能以葡萄糖为碳源产生异丁酸、异丁醇等产物，酵母提取物添加使异丁酸产量从5.4 μM提升至56.4 μM。最终工程菌株C18 T7经多轮改造后，摇瓶发酵产量达26.8 ± 1.5 mM异丁酸，碳收率为0.12 g/g葡萄糖，约为理论最大值的25%。酶活测定证实Kivd等关键酶在工程菌株中高效表达。删除panB和ilvE分别使滴度提高约2.5倍和1.5倍。该研究通过组合代谢工程策略，成功将VLB120开发为高效好氧生产异丁酸的平台菌株，为后续连续化生物过程及其他增值代谢物的生产奠定了基础。
创新点
首次将 Pseudomonas sp. strain VLB120 开发为异丁酸生产平台；采用 T7 表达系统替代 Alk 启动子实现高效表达；结合定向敲除与 NTG 随机突变解决产物降解和竞争途径问题；实现了纯好氧条件下的异丁酸发酵生产。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 缬氨酸合成途径 | alsS | 乙酰乳酸合酶 | 催化 | 来自 Bacillus subtilis，催化两分子丙酮酸生成乙酰乳酸，为缬氨酸合成提供前体。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 缬氨酸合成途径 | ilvC | 酮醇酸还原异构酶 | 催化 | 内源基因 (PVLB_03705)，催化乙酰乳酸还原异构化为2,3-二羟基异戊酸。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 缬氨酸合成途径 | ilvD | 二羟酸脱水酶 | 催化 | 内源基因 (PVLB_01425)，催化2,3-二羟基异戊酸脱水生成2-酮异戊酸（2-KIV）。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | Ehrlich途径 | kivd | 2-酮酸脱羧酶 | 催化 | 来自 Lactococcus lactis，催化2-酮异戊酸脱羧生成异丁醛。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 异丁酸降解途径 | bkd | 支链α-酮酸脱氢酶E1亚基 | 催化 | 基因 PVLB_17450，催化2-KIV氧化脱羧为异丁酰-CoA，删除该基因可阻止2-KIV降解。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 缬氨酸/亮氨酸合成竞争途径 | ilvE | 支链氨基酸转氨酶 | 催化 | 催化2-KIV转氨生成缬氨酸，删除可减少前体竞争。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 亮氨酸合成途径 | leuA | 2-异丙基苹果酸合酶 | 催化 | 催化2-KIV转化为2-异丙基苹果酸，是亮氨酸合成第一步，删除后滴度未提高甚至下降。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 泛酸合成途径 | panB | 2-酮异戊酸羟甲基转移酶 | 催化 | 催化2-KIV羟甲基化，是泛酸/CoA合成第一步，删除后异丁酸滴度提高约2.5倍。 |
| Pseudomonas sp. strain VLB120 | 回补途径 (TCA循环) | pycAB | 丙酮酸羧化酶 | 催化 | 催化丙酮酸羧化生成草酰乙酸，删除后对异丁酸滴度无显著影响。 |
关键发现
- 过表达 kivd 后，VLB120 能以葡萄糖为碳源产生异丁酸、异丁醇和3-甲基-1-丁醇；添加酵母提取物后异丁酸产量从5.4 μM提高到56.4 μM。通过删除 bkd 和竞争途径（尤其 panB 和 ilvE）并过表达缬氨酸合成途径及 Ehrlich 途径，最终工程菌株 C18 T7 在摇瓶发酵中产生高达
- 8 ±
- 5 mM 异丁酸，碳收率为
- 12 ±
- 01 g g_lc^-1（约为理论最大值的25%）。酶活测定显示，VLB120 T7 pPAPC-Km, pPDPK 中 AlsS 活性为
- 494 ±
- 299 μmol min^-1 mg^-1，IlvC 为
- 1476 ±
- 0425 μmol min^-1 mg^-1，IlvD 为
- 1955 ±
- 0023 μmol min^-1 mg^-1，Kivd 为
- 96 ±
- 24 μmol min^-1 mg^-1；而野生型中 Kivd 活性不可检测。删除 panB 使异丁酸滴度提高约2.5倍，删除 ilvE 提高1.5倍。
研究结论
通过组合策略——增加向异丁酸的通量、定制表达系统、防止前体和产物降解——在 Pseudomonas sp. strain VLB120 中实现了异丁酸的高效生产，为该菌株作为好氧平台生物催化剂生产异丁酸及其他增值代谢物奠定了基础，并为未来连续化生物过程提供了可能。