Increased expression of the yeast multidrug resistance ABC transporter Pdr18 leads to increased ethanol tolerance and ethanol production in high gravity alcoholic fermentation
- 作者
- Miguel C Teixeira, Cláudia P Godinho, Tânia R Cabrito, Nuno P Mira, Isabel Sá-Correia
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2012）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-11-98
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酵母在工业酒精发酵中面临高浓度乙醇的毒性胁迫，导致乙醇生产率下降和发酵停滞，需要提高酵母乙醇耐受性以增加乙醇产量
研究策略
通过筛选21个ABC和MFS多药耐药转运蛋白缺失突变体，鉴定出PDR18在乙醇耐受中的关键作用；进一步通过基因工程将PDR18天然启动子替换为强启动子PDR5，构建PDR18过表达工程菌，评估其在高重力发酵中的乙醇产量
核心内容
本研究通过筛选酿酒酵母中21个ABC和MFS多药耐药转运蛋白缺失突变体，鉴定出Pdr18在乙醇耐受中发挥关键作用。乙醇胁迫下，Δpdr18突变体延滞期延长至10小时（野生型仅2小时），且细胞内3H-乙醇积累量约为野生型的2倍，表明Pdr18通过影响质膜麦角固醇掺入、降低乙醇诱导的膜通透性来减轻乙醇毒性。进一步利用染色体启动子替换策略，将PDR18天然启动子替换为强启动子PDR5，构建了PDR18过表达工程菌。在30%葡萄糖高重力发酵中，该过表达菌株的最终乙醇浓度较野生型提高6%（达约18% v/v），乙醇生产产量提高17%（达55.6 g乙醇/g葡萄糖），而Δpdr18菌株的最终乙醇浓度比野生型低10%。此外，过表达菌株的PDR18 mRNA水平约为野生型的2倍，且膜通透性在发酵6小时时降低13倍。该研究首次揭示了Pdr18通过膜脂调控介导乙醇耐受的机制，所采用的染色体启动子替换策略避免了质粒依赖，为工业酵母菌株提升生物乙醇生产效率提供了可行方案。
创新点
首次发现Pdr18通过影响质膜麦角固醇掺入和降低乙醇诱导的膜通透性来提高乙醇耐受性；采用染色体启动子替换策略构建PDR18过表达菌株，避免质粒依赖，适用于工业高重力发酵
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 乙醇发酵/膜脂代谢 | PDR18 | Pdr18 | 转运 | ABC多药耐药转运蛋白，参与质膜麦角固醇掺入，降低乙醇引起的膜通透性和细胞内乙醇积累 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741_Δpdr18 | 乙醇发酵 | PDR18 | Pdr18 | 转运 | PDR18缺失突变体，乙醇耐受性和发酵性能下降 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741_+PDR18 | 乙醇发酵 | PDR5 promoter | — | 调控 | 用PDR5强启动子替换PDR18天然启动子，实现染色体水平的PDR18过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 乙醇发酵 | ACT1 | Act1 | 调控 | 作为RT-PCR内参基因，用于定量PDR18表达 |
关键发现
- 在乙醇胁迫下，Δpdr18突变体延滞期延长至10 h（野生型为2 h），且细胞内3H-乙醇积累量约为野生型的2倍
- PDR18过表达菌株在对照条件下膜通透性降低10倍，发酵6 h时降低13倍
- 在高重力发酵（30%葡萄糖）中，Δpdr18菌株最终乙醇浓度比野生型低10%，而PDR18过表达菌株最终乙醇浓度提高6%（达约18% v/v vs 野生型17%），乙醇生产产量提高17%（达到55.6 g乙醇/g葡萄糖），野生型和Δpdr18菌株的产量约为47.5 g/g
- PDR18表达在发酵过程中逐渐上调，过表达菌株的PDR18 mRNA水平约为野生型的2倍
研究结论
PDR18过表达可提高酵母乙醇耐受性和高重力发酵中的乙醇产量，将PDR18启动子替换为PDR5启动子的工程菌策略有望应用于工业酵母菌株以提升生物乙醇生产的可持续性